[摘要] 目的 為研究潛在功能基因在小鼠指甲生長過程中的作用，在國外研究基礎上建立并優化指甲干細胞的小鼠指甲再生模型。方法 以8周齡C57BL/6小鼠為實驗對象，通過麻醉后在顯微鏡下精準位置截肢處理進行動物造模、通過實時觀察記錄、取樣測量、切片染色等一系列研究方法的探索與實踐，對研究步驟進行適當優化。結果 形成了系統的小鼠指甲再生模型研究手段。結論 該模型能夠在動物整體水平、組織水平對小鼠指甲生長情況進行評估，可以成為研究指甲干細胞及相關功能基因的有效手段。

　　[關鍵詞 ] 指甲再生; 長度測量; HE染色

　　指甲是皮膚的附屬品，具有保護手指末端皮膚, 加強手指運動力量以及維持手指精密感覺功能等作用[1,2]。因此，指甲損傷后的修復十分重要。哺乳動物的指甲主要由四部分組成: 甲板, 甲床, 甲襞以及指甲基質[3]。位于甲床根部區域的指甲干細胞控制著指甲和指頭的再生，然而這種能力是非常有限的: 如果指頭在超過指甲的地方被截掉(也就是干細胞區被破壞)是不會再生的。2013年, Takeo等[4] 發現了位于指甲干細胞區域遠端的指甲祖細胞在一個依賴于 Wnt 信號作用的過程中分化成指甲。目前，在指甲干細胞方面的研究報道比較少，而國內對于該領域的研究基礎更差。本研究在前人研究基礎上對指甲再生模型進行了優化，旨在建立一套指甲干細胞研究模型，形成系統的指甲再生研究方法，為研究Wnt信號通路相關基因在指甲再生過程中的功能提供技術支持。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物

　　SPF 級 8 周齡 C57BL/6 的小鼠雌雄各 5 只，體質量約 25 g 左右，華東師范大學實驗動物中心提供[SCXK(滬)2016-0004]，飼養于屏障設施[SYXK (滬)2015-0011]，動物實驗符合華東師范大學動物倫理委員會的規定并被授權。

　　1.2 試劑、儀器設備

　　質量分數 5% 的水合氯醛、質量分數 10% 的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液均購自美國 Sigma 公司; 質量分數4%多聚甲醛(PFA)購自上海潤捷化學有限公司; 各濃度梯度乙醇購自上海凌峰化學試劑有限公司; 尼康顯微鏡SMZ745購自日本Nikon公司; 冰凍切片機、石蠟包埋機和組織脫水一體機均購自德國 Leica公司; 正置顯微鏡購自日本Olympus公司。

　　1.3 小鼠指甲再生模型的建立

　　取 8 周齡 C57BL/6 小鼠雌雄各 5 只，每只給予 5% 水合氯醛 0.16 mL 進行麻醉，小鼠置于 37 ℃加熱平板上維持體溫。在顯微鏡下逐一截取實驗小鼠左后肢中間的三個指甲進行取材，右后肢作為對照，截取位置如圖 1A 中黑實線所示，與肉眼可見部分的指甲根部呈約 15 ℃角，使截取位置恰在甲床的 Wnt 信號激活區域[4](圖 1A 右紅色區域)，同時不傷及甲床的干細胞區[4](圖1A 右綠色區域)。用酒精棉球輕柔按壓指甲傷口15 s止血。3周后，截取實驗小鼠雙后肢中間的三個腳趾進行取材。模型建立時間軸如圖 1 B 所示。

　　1.4 模型數據的采集

　　造模3周后取材時，在顯微鏡下調好標尺，分別測量實驗小鼠正常指甲和再生指甲的長度，測量位置如圖 2A 和 2B 中黑實線所示，記錄指尖最頂端與肉眼可見部分的指甲根部的距離。

　　1.5 石蠟切片的制作及染色

　　將截下的小鼠腳趾放入盛有 10% EDTA 脫鈣液的 1.5 mL EP 管中，四度搖床上脫鈣反應 14 d。用 4% 多聚甲醛(PFA)在 4 ℃冰箱中固定樣品過夜，用組織脫水一體機將樣品在乙醇/二甲苯中梯度脫水，最后浸蠟用石蠟包埋機進行包埋。用石蠟切片機切成約0.5 mm厚度的切片(小鼠指甲切片只有縱軸面上的形態是完整的，所以每個腳趾包埋的蠟塊大概只能切出 3~4 片形態完整的切片)。將小鼠指甲的石蠟切片置于二甲苯-酒精-水梯度濃度中進行脫蠟，蘇木精染色 5 min 后返藍，脫水至 95%酒精時染伊紅 6 0 s ，繼續脫水，樹脂膠封片。

　　1.6 統計學處理

　　本文中的數值均以x -± s的形式給出，并根據不同實驗要求對數據進行成對或組間t檢驗, P<0.05 為差異有統計學意義。

　　2 結果

　　記錄數據顯示，在該模型下建立的小鼠再生指甲可以恢復生長，與正常指甲長度的差異沒有統計學意義(圖 3A)。顯微鏡下觀察小鼠指甲 HE 染色切片，顯示小鼠再生指甲具有與正常指甲相似的結構形態(圖 3 B、3C)。

　　3 討論

　　最近研究[5]顯示，小鼠指甲附近的干細胞在指尖再生過程中是不可或缺的。進一步說明指甲干細胞無論是在指甲生長過程中還是在指尖再生過程中都發揮著重要作用。在 Takeo 等[4]研究基礎上， Tabin 團隊[6]證明了 G蛋白偶聯受體 Lgr6在指尖再生過程中表達必不可少。但該領域國內相關研究成果極少，造模時由于指甲內部形態結構不可見，很容易造成同組之間指甲再生情況參差不齊。本研究對指甲再生模型進行了量化優化，使造模時可以在顯微鏡下準確地截取至甲床的 Wnt 信號激活區域，為研究Wnt信號通路相關基因在指甲再生過程中的作用提供了技術保障。利用該模型，可以進一步發掘Wnt信號通路相關基因(比如G蛋白偶聯受體家族)在指甲生長與指尖再生過程中的功能。Shi 等[7]研究表明，keratin 15 (K15), keratin 14 (K14), keratin 19 (K19), CD29, CD34和 Lgr6可能是潛在的 小鼠指甲干細胞的標記基因。可見，小鼠指甲干細胞領域具有廣闊的研究前景，該模型也需要不斷地優化完善，成為研究指甲干細胞的有力手段。隨著該領域研究的不斷成熟，在不久的將來，爭取實現指甲干細胞的體外培養，為臨床上手指或者腳趾截肢的患者帶來治愈的新方法。

　　推薦閱讀：農田鼠形小獸群落生態演替現象分析

　　論文摘要:上海郊區農田主要鼠形小獸有黑線姬電和大路晌。1988、工989年在郊區嘉定縣農田以夾夜法調查，發現農田鼠形小獸群落結構發生了很大變化，與60年代初相比，大解豹的構成比從甘腸上升到80腸左右，黑線姬鼠則從80%以上下降到20腸左右，這可能與近年來郊區農田開展經常性滅鼠工作有關。