摘 要：非典型增生腺瘤(Atypicaladenomatoushyperplasia，AAH)和鱗狀細胞增生(squamouscelldysplasia，SCD)與肺部惡性損傷的發展有相關性，精確診斷 AAH 和SCD有助于早期確診肺癌，同時有助于肺癌高危人群的篩查與早期干預。本項目利用免疫反應原理，將噬菌體展示技術與生物淘洗技術相結合，獲得可表達腫瘤相關蛋白的噬菌體特異性文庫，并將噬菌體點制在生物芯片上，篩選得到了與肺部損傷相關的特異性蛋白，經測序分析鑒定出多種自身抗體為惡性腫瘤相關蛋白。最終，通過數據分析，建立篩選分類器，制成篩查檢測芯片，用于篩查 AAH 與 SCD，評估早期肺癌風險，表現出重要的臨床診斷應用前景。

　　關鍵詞：肺癌;吸煙;標志物;AAH;SCD;自身抗體

　　1 研究背景

　　肺部腫瘤是實體瘤發病率與死亡率中占比較大的病種，國家癌癥中心的統計報告顯示，全國惡性腫瘤發病第1位的是肺癌，每年新發病例約78.1萬。在長期吸煙的人群中，導致肺癌的比例高達90%。特別是在中國，不斷上升的吸煙人群數量導致的肺癌發病率持續上升。近年來，在肺癌治療領域取得了越來越多的進展，證實了早期發現對于肺癌的成功治療及生存期的延長至關重要。數據統計顯示，經過手術治療的所有1A 期非小細胞肺癌患者，5年生存率大約為80%。經過手術治療的所有ⅠB期非小細胞肺癌患者，5年生存率大約為60%。Ⅱ期非小細胞肺癌，經過手術治療的所有Ⅱ期非小細胞肺癌患者，5年生存率大約為40%-50%，而ⅡA 期，Ⅲ期，Ⅳ期的生存率則逐漸降低。因此，準確診斷早期惡性肺癌或早期惡性腫瘤的新技術對于提高患者生存率大有裨益。

　　非典型性腺瘤性增生(AAH)和鱗狀細胞發育不良(SCD)分別被報道為肺腺癌和鱗狀細胞癌的前體[1，2]。Wistuba和 Gazdar之前已經描述了由健康組織到腫瘤前病變和惡性疾病的進展過程[3]。簡單來說，對于鱗狀細胞癌，在染色體3p21和9p21上的雜合性喪失可能導致端粒酶功能障礙。細胞周期調控基因的DNA 甲基化，如p16INK4a，以及FHIT和 TP53等腫瘤抑制基因中的 LOH 進一步促進了上皮組織細胞生長的失調，最終導致了原位癌和轉移性疾病。對于腺癌，主要是ras致癌基因的通路(吸煙者)或表皮生長因子受體通路(非吸煙者)基因的突變導致組織生長失調，最終導致腺癌。

　　目前應用最廣泛的臨床檢測前腫瘤性肺 SCD 病變的方法包括：白光支氣管鏡(WLB)和自動熒光支氣管鏡(AFB)。Chen等人[4]回顧了492份論文和14項研究，共包含了適合進行meta分析的15個數據集，證實了 WLB和 AFB的敏感性和特異性，且最終都經組織學檢測進行了驗證。AFB的混合敏感性和特異性分別為0.90 (95% CI0.840.93)和0.56 (95% CI0.45-0.66)，而 WLB為0.66(95% CI0.58-0.73)和0.69(95% CI0.57-0.79)。因此，據報道 AFB在發現肺癌和腫瘤前SCD病變方面優于 WLB，然而這項技術對操作人員的技術需要較高，并且需要內窺鏡插入人體肺部進行檢測，屬于侵入性檢測，會造成患者的不適。

　　非典型增生腺瘤出現在肺實質組織周圍，主要涉及進行氣體交換的肺泡位置。非典型增生腺瘤造成的損傷經常是較小的、無癥狀的，射線下觀察不到的，因此常常需要使用螺旋 CT以及外科手術后的組織活檢作為診斷方式，并且該病常常會在不明確的區別點形成支氣管肺泡細胞癌(BAC)[5]，臨床目前根據損傷大小進行區別，小于等于5mm 的認為是 AAH，當大于5mm 時定義為 BAC/腺瘤。盡管有一些成功的方法可以篩查一些肺癌的高發人群，但是僅使用螺旋 CT在區別 支 氣 管 癌、腺 癌、非典型增生腺瘤時仍然存在一定的難度，假 陽 性 率 約 為20-35%[6，7]。

　　除了這些具有侵入性的檢測方式，以血液中的生物標志物為基礎的檢測方法引起了廣大科研工作者的興趣，檢測與腫瘤相關抗原的血清抗體(TAAs)可以為早期癌癥提供更可靠的診斷信息[8，9]。免疫系統的敏感性極高，可以檢測到人體中少量腫瘤細胞通過大量激活 T 細胞而產生的 TAAs。據報道，自身抗體p53可在早期卵巢癌和結直腸癌患者體內檢測到[10]，另外，應用血清自身抗體組合可以比放射檢測法早5年檢測發現非小細胞肺癌(NSCLC)[11]。30%的導管原位癌患者可以檢測到原癌基因 HER-2/neu被過度表達的相應血清抗體[12]。因此，根據身體免疫系統這種自然的抗體倍增效應原理，通過檢測抗體來檢測病變前肺癌的方案是合乎邏 輯 的，也是切實可行的。本研究就是利用血清中存在的損傷特異性抗體來檢 測AAH 和SCD肺損傷。這種方法是一種有效的、非侵入性的評價肺癌風險的方案。

　　2 方法與材料

　　2.1 研究人群

　　2012年-2016年間就診于河北大學附屬醫院的1500例高危患者(年齡大于55周歲，每年吸煙大于25包)，患者血清取自治療前，之后行支氣管內窺鏡及低劑量螺旋 CT 檢測，并對不規則組織或者可疑組織進行活檢，對于確診 SCD 或者 AAH 的樣本納入本項研究，并從六個患者肺部取下三份SCD組織，三份 AAH 組織構建cDNA 文庫。另外，收集600份血清，其中150份 AAH，150份SCD，300份正常對照樣本。采用靜脈采血的方法使用紅色蓋的采血管抽血，血液靜置30min后，離心分離血清，分裝后-80℃保存。表1列出血清的詳細信息。

　　2.2 RNA提取及T7噬菌體構建

　　使用上述提到的組織分別構建 AAH 和 SCD 的 噬 菌 體 文 庫。使 用 RNeasy MiniKit(Qiagen).試劑盒提取總 RNA，使用 OligotexDirectmRNA MiniKit(Qiagen)分離 mRNA，并測定 mRNA 濃度，調整濃度一致后，隨機引物反轉錄成cDNA，加入2μLDirectionalEcoRI/HindIIILinker，在 T4DNA 連接酶的作用下16℃連接過夜。之后，分別加入 EcoRI和 HindIII各100U，37℃溫育2h消化接頭，得到兩端分別有 EcoRI和 HindIII粘性末端的雙鏈cD-NA。之后，連接進 T7噬菌體，通過噬菌斑測定，確定文庫的滴度。

　　生物淘洗使用 AAH/SCD 及正常血清樣本，為了去除非腫瘤相關蛋白，先使用正常血清與封閉的 G 蛋白珠反應，非特異性的噬菌體將結合在蛋白珠上，未結合的噬菌體再與 AAH 和SCD血清反應，之后將結合的噬菌體洗脫并富集，反復淘洗四次，獲得 AAH/SCD 特異性噬菌體文庫。反應的步驟按照 Novagen公司 T7SelectBiopanningKit說明書進行。四次淘洗之后的噬菌體感染細菌并在固體培養基上測定滴度。之后選擇并確定合適的稀釋度，以獲得單克隆的噬菌斑，測試結果是稀釋107-108時可以看到單克隆的噬菌斑。

　　為了確定生物淘洗富集的噬菌體的程度，將四次淘洗的結果分別在瓊脂板上培養，形成1-4號培養板，并將板上的噬菌體轉印到硝酸纖維素膜上，將 AAH/SCD患者血清與膜進行免疫反應，血 清 按1∶2000稀 釋，之 后 加 HRP-標 記 的 二 抗，二 抗 以1∶1000稀 釋，之 后 使 用ECL化學發光法進行檢測。結果顯示，從 BP1到 BP4反應活性噬菌體的量逐漸增加。另外，為了確定噬菌體的特異性，在 BP4上轉印兩張相同的硝酸纖維素膜，分別與 AHH/SCD 和正常人血清反應，之后加 HRP標記的二抗，用 ECL化學發光法觀察結果。

　　2.3 高通量芯片篩選

　　通過四輪的生物淘洗，獲得了4000個獨立的噬菌體克隆，分別在96孔板上培養富集。每孔加入150μLE.coliBLT5615細胞，37℃ 培養3h，培養之后，取30μL上清轉入384孔板，空噬菌體 T7文庫也分別加到384孔板中，作為內對照。之后使用 Gesim 公司的 NP2.1型點樣儀進行芯片的點制。

　　使用5份 AAH 和5份SCD 血清進行芯片反應，(以上10份樣本應該為非制作噬菌體文庫的血清樣本)，兔抗 T7噬菌體的二抗用來作為內對照，血清用細菌培養基30倍稀釋，T7抗體1∶3000稀釋(用 TBST稀釋)，室溫反應1h，芯片沖洗后，與Cy-5標記的抗人抗體和Cy3標記的抗兔抗體反應，二抗分別稀釋4000倍，室溫反應1h，之后用 GenePix4000B掃描儀掃描，并用 GenePix5.0分析軟件進行結果分析，并對Cy5∶Cy3的數據進行線性回歸，對于比值高于兩倍標準偏差的蛋白可以做為候選蛋白。

　　2.3 用診斷芯片進行血清樣本檢測

　　將400個篩選出的噬菌體克隆以及200個空噬菌體分別進行富集，之后點制在芯片上，制成診斷用芯片。使用50例 AAH，50例SCD 以及100對照，組成訓練集，按上述方法進行檢測，通過算法，獲得分類器，之后再選擇400份血清對分類器進行驗證，包括100份 AAH，100份SCD，200份對照，檢測后分別用 AAH 和SCD的分類器進行評估。最終結果與實際樣本信息進行對比，統計敏感性與特異性。

　　2.4 數據分析與統計模型構建

　　用 Cy5中位數與 Cy3中位數的比值作為血清中噬菌體蛋白的表達值，為了平衡芯片間的差異，根據公式[(噬菌體蛋白 Cy5/Cy3)-(空 T7Cy5/Cy3)]/(空 T7Cy5/Cy3)對所得數據進行標準化處理。歸一化之后的 Cy5：Cy3值作為每一個噬菌體克隆的數據進行統計，之 后 將AAH 樣本和SCD樣本，正常樣本的數據在JMP統計軟件上進行t-檢驗，選擇 P值<0.01的蛋白做為候選標志物，并歸集成不同的分類器。為了獲得更準確的分類器模型，又使用 SAS統計軟件進行了 LR 邏輯回歸分析，對模型中的蛋白分別進行了權重計算，并且建立了 ROC曲線，形成一種最佳的疾病診斷模型。

　　2.5 測序鑒定

　　對于分類器篩選出的噬菌體的測序鑒定，使用的是商業化的噬菌體通用引物進行 PCR 擴增，上 游 引 物：5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′，下 游 引 物：5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′。PCR產物純化后測序，測序結果在 GeneBank數據庫中進行 BLAST比對。3 實驗結果3.1 生物淘選噬菌體文庫使用 AAH 或者SCD患者的組織進行 T7噬菌體文庫的構建，測定文庫滴度，AAH 文庫5.5×106，SCD 文 庫3.8×106。經 過 PCR 檢 測，結果顯示噬菌體中插入的片段約為0.5-2kb，證明文庫構建成功。

　　將以上兩個文庫混合，使用 AAH/SCD 及正常血清樣本進行生物淘洗，篩選在噬菌體上表達的腫瘤相關抗原，使用患者血清作為基礎抗體來源，免疫檢測顯示，反復多次的淘洗和噬菌體擴增，可以獲得更大量的免疫反應噬菌體(圖1)。以上免疫反應表明了噬菌體表面表達蛋白與病人血清中抗體的高親和力。同時，相比之下，某些克隆與正常血清并未發生免疫反應，即這些克隆為病人特異性相關克隆，而正常血清也反應的克隆即為表達非特異蛋白的背景性噬菌體克隆。

　　圖1中，為了確定生物淘洗的富集效果，淘洗結果展示在 LB培養基上，其中 BP4顯示了比BP3更多的免疫反應性。舉例說明了使用患者的血清連續富集可獲得腫瘤相關抗體。為了驗證富集的蛋白的特異性，用兩個硝酸纖維素膜在 BP4的培養基上印一下，一個用 AAH/SCD血清反應，另一個用正常血清反應。多個免疫反應克隆在疾病組顯示免疫特性，而正常組無反應。

　　3.2 高通量篩選

　　從 BP4的噬菌體文庫中隨機篩選出4000個噬菌體并點制在附有薄膜涂層的微陣列芯片上，之后用5個單獨的 AAH 或 SCD 患者 血 清(非生物淘洗用樣本)樣本與芯片反應。根 據Cy5∶Cy3信號篩選出了238個 AAH 相關噬菌體，193個SCD相關噬菌體。再次篩選信號比大于2個標準差的噬菌體，作為診斷芯片構建的候選噬菌體。圖2展示了 Cy5∶Cy3線性回歸的結果。

　　噬菌體克隆點制在芯片上，檢測患者血清樣本，圖2展示了部分 AAH 和 SCD 患者樣本的芯片圖，以及芯片掃描的熒光值對應的散點圖。

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　　3.3 統計分析

　　通過高通量篩選，再次挑選出來400個免疫活性噬菌體，加上200空T7噬菌體，一起點制在芯片上制成診斷用芯片。點制多張芯片，分別用于評估50個 AAH 和50個SCD，以及100個對照正常血清樣本，形成一個訓練集。分別進行歸一化，并統計400個噬菌體在正常血清和疾病血 清 中 的 Cy5∶Cy3比 值。通 過 T 檢驗獲得每個蛋白的cut-off值。經 過 檢 測，47 例AAH，39例SCD超過設定的cut-off值。

　　根據P值，收集前30個噬菌體克隆，進行組合，然后使用邏輯分析，選最優敏感性的回歸算法，區分病人和正常人。通過測試，結果使用9種噬菌體，對于 AAH 最高預測敏感性可達92.3%，特異性90.2%。使用LOOCV(leave-one-outcross-validation)算法這些結果得到進一步驗證，ROC曲線得到 AUC=0.874。因此，9個噬菌體蛋白質的組合在 AAH 中顯示出最精確、穩定的分類效果。同樣的方法在對SCD測試時表現出更好的效果，敏感性98.3%、特異性95.6%，同樣使用 LOOCV 算法驗證，ROC曲線得到 AUC=0.959。最終使用13種噬菌體的組合在SCD中顯示出最精確、穩定的分類效果。