摘要 細胞周期(cell cycle)是一種非常復雜和精細的調節過程, 該過程是連續而不可逆的。細胞周期紊亂與很多疾病的發生發展有關, 如腫瘤等。目前的研究發現, 表觀遺傳學(epigenetics)可以通過影響細胞周期關鍵性調控因素而調控細胞周期。DNA甲基化(DNA methylation)是最常見的表觀遺傳修飾方式, 其在基因的轉錄、基因組的穩定性和細胞周期的調控中發揮重要的作用。因此, 該文重點對近年來DNA甲基化在細胞周期調控中的研究進展作一綜述, 以期為提高腫瘤等疾病的臨床診斷和治療水平提供理論依據。

　　關鍵詞 表觀遺傳學; DNA甲基化; 細胞周期

　　表觀遺傳學(epigenetics)修飾是指在DNA序列沒有發生變化的情況下, 基因功能發生可遺傳變化, 并最終導致了表型的變化。表觀遺傳學修飾的方式主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA、染色質重塑及基因組蛋白印記。DNA甲基化(DNA methylation)是最早發現的表觀遺傳修飾之一[1], 它在調控基因轉錄水平、染色體結構的穩定性、基因印記和染色體失活等方面發揮重要的作用[2]。近年來的研究發現, DNA甲基化異常會導致細胞周期紊亂, 從而引起疾病的發生, 如腫瘤等。

　　1 DNA甲基化

　　DNA甲基化是哺乳動物基因組主要的表觀遺傳學調節機制。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNMTs)的催化作用下, 將S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)中的甲基轉移到胞嘧啶的第5位碳原子上, 形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC)[4]。已知哺乳動物體內共有5種DNMTs家族成員: DNMT1、 DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。其中, DNMT1是維持甲基化酶, DNMT3A和DNMT3B是重新甲基化酶。研究發現, DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B除了能識別5-mC的生物功能外, 還參與了基因組中5-mC的維持和產生機制[5]。在脊椎動物中, CpG二核苷酸是DNA甲基化發生的主要位點。其中, CpG島(CpG island)是指基因上富含CpG的序列, 常位于轉錄調控區附近。

　　DNA甲基化對基因表達的調節主要通過兩種途徑完成, 一是通過甲基化的CpG二核苷酸來影響 DNA結構, 進而直接阻礙轉錄因子與靶基因的結合; 二是甲基化結合蛋白(如MeCP2)與基因中甲基化的 CpG二核苷酸相結合, 誘導染色體的狀態改變, 從而抑制基因的轉錄。DNA甲基化模式是動態的, 以適應環境等的變化[6]。研究表明, 腫瘤等疾病是細胞周期異常性疾病, 異常甲基化影響細胞分裂的生物學穩定性[7]。CpG島的高甲基化可導致抑癌基因(如參與細胞周期的調控、DNA修復和細胞凋亡等的基因) 沉默; CpG低甲基化可導致癌基因活化[8]。另外, 在腫瘤細胞中DNMTs的活性增高可導致未甲基化的抑癌基因啟動子CpG島的甲基化程度增高[9]。

　　2 細胞周期及其調控

　　細胞周期(cell cycle)是指正常連續分裂的細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂結束的過程。根據各個時期的特點不同, 它可以將遺傳信息 DNA精確地復制并通過有絲分裂的方式分配到子代細胞中。細胞周期包括靜止期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2 期)和有絲分裂期(M期)。真核細胞經常受各種不利環境因素(如電離輻射、化學毒物、紫外線等)的影響而導致DNA突變, 從而引起腫瘤及其他疾病的發生。為確保細胞周期的正常運行和遺傳信息的穩定遺傳, 細胞在長期的進化過程中逐漸形成了一整套細胞周期正常運行的機制, 其中最重要的是細胞周期檢測點, 也被稱為DNA損傷檢測點。數據顯示, 研究最多的是G1/S期檢測點、G2/M期檢查點、中/后期檢查點(又稱紡錘體組裝檢查點)。這些檢測點使細胞周期進程減慢或阻滯細胞周期進程, 以提供給細胞充足的時間用于修復受損的DNA, 從而保證細胞周期有序運行, 以應對不利因素的影響。然而, 不利的環境等可能引起檢測點調控異常, 從而導致腫瘤[10]、帕金森病[11]、阿爾茨海默病[12]等疾病的發生。

　　3 DNA甲基化對細胞周期檢測點的調控

　　3.1 DNA甲基化對G1/S檢測點的調控

　　細胞周期中G1時程的長短與細胞增殖分化狀態密切相關[13]。Gl期檢查點是細胞周期調控的關鍵, Gl期細胞周期蛋白的異常表達很可能引起細胞周期失調, 從而促進疾病的發生。細胞周期的調控是通過有正向調節作用的細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)與負向調節作用的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitions, CDKI)相互作用來實現的。CDK使抑癌基因Rb的蛋白產物磷酸化, 使細胞進入S期; 而CDKI 則抑制CDK活性, 阻斷Rb磷酸化, 使細胞停滯于G1 期, 進而發生分化、凋亡或進入靜止期。p16、p27、 p21、p57、p53、PENT等基因是細胞生長周期中的負調節因子, 主要參與G1/S檢測點的調控。它們與細胞周期的調控、細胞凋亡、DNA修復、細胞分化等重要的生物學功能有關。

　　3.1.1 p16 p16是一種抑癌基因, 位于人類第9號染色體21號短臂上, 包含2個內含子和3個外顯子。 pRb是遺傳性視網膜母細胞瘤中發現的抑癌產物, 當CyclinD與相應CDK結合為激酶復合物時可對 pRb磷酸化, 磷酸化的pRb可釋放其結合的轉錄因子 E2F, E2F因子控制并參與細胞增生、生長、分化、凋亡基因的表達, 這些基因的產物促進細胞進入S 期, p16與cyclinD競爭結合CDK4/6使其失活, 從而抑制Rb蛋白磷酸化, 進而阻止細胞周期由G1期進入S 期[14]。研究發現, p16基因的主要失活機制是p16基因啟動子區的超甲基化, CpG島的超甲基化抑制p16 轉錄, 進而導致其表達產物p16蛋白的缺失[15]。相反, CPG島低甲基化可使p16基因回復正常的轉錄[16]。研究表明, p16基因超甲基化使cyclinD依賴性蛋白激酶的活性增高, 導致Rb蛋白異常磷酸化, 從而使細胞繞過正常細胞周期檢查點增加細胞增殖和基因組的不穩定性; 同時, p16基因超甲基化可激活cyclinDlCDK4/CDK6-PRb-E2F的環路, 使其無限制反復進行, 使細胞周期由G1期進入S期, 最終導致細胞過度增殖及腫瘤的發生[17-18]。Umemura等[19]的研究表明, 血漿中p16基因啟動子甲基化可在早期肺癌中被發現, 提示抑癌基因甲基化是腫瘤發生的早期事件。

　　3.1.2 p27 p27基因定位于染色體12p12~13.1, 其編碼的蛋白質含有198個氨基酸, 由2個外顯子和2個內含子組成。研究表明, G1期是其主要作用點, 具有阻止細胞通過G1/S期轉化的“關卡”作用。p27對 CDK的抑制作用表現為三方面: 即p27可抑制CDK 的激活過程、p27也可抑制已經激活的cyclin/Cdk的激酶活性、p27還可通過阻止Rb蛋白磷酸化控制細胞周期G1/S轉變的進程。DNA甲基調控主要通過 DNMTs, 該酶作用于p27甲基化酶位點Sma I、Hha I、 Ava I。三個酶的作用位點位于DNA的胞嘧啶鳥瞟呤富含區, 該區域與RNA聚合酶II轉錄基因的啟動子有60%的一致性, 甲基化DNA的胞嘧啶干擾了反式作用因子, 使p27的轉錄產生障礙[20], 抑制了p27蛋白和mRNA的表達, 導致p27基因沉默, 使細胞大量分化和增生。

　　3.1.3 p21 p21蛋白是CIP家族中的一員, 人類的 p21基因位于6p21.2, 全長約11 Kb, 含有3個外顯子和2個內含子。它是位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子。當DNA損傷發生在Gl期時, p21可通過抑制CDK活性來阻止細胞進入S期, 從而抑制DNA復制; 當DNA損傷發生在S期時, p21可通過使DNA聚合酶的相關因子失活而抑制DNA合成, 從而使細胞修復, 保證遺傳物質準確地傳遞給子代, 從而避免了由于DNA損傷的累積而導致的腫瘤發生的可能性[21]。研究表明, DNA甲基化和組蛋白乙酰化可使p21基因失活[22]。其中, 由于在轉錄起始位點周圍p21啟動子含有高密度的甲基化CpG二核苷酸聚集[23], 因此易發生甲基化。此外, p21與Cyclin、 CDK和PCNA以四聚體形式存在, 其中p21蛋白在其第144~151氨基酸上存在PCNA結合區域。PCNA是一種分子量為36 kDa的蛋白質, 為DNA聚合酶的輔助蛋白。p21影響PCNA的功能主要依賴于其抑制了PCNA和其他功能蛋白的結合。目前發現至少有兩種DNA代謝酶可以與p21競爭PCNA的結合, 其中包括DNMT1。DNMT1可以直接和PCNA結合, 它們的結合會被p21蛋白第141~160位氨基酸殘基阻斷, 因此, DNA復制過程中p21蛋白可以調控DNA甲基化的水平。所以通常認為, 在哺乳動物細胞中p21對 DNMT1與PCNA結合是負調控[24-25], p21從PCNA復合物中的丟失可引起DNA損傷修復期間甲基化的異常增加[26]。

　　3.1.4 p57 人類的p57基因定位于11p15.15上, 含有4個外顯子和3個內含子, 其中, 2個外顯子位于編 碼 區 內。p57與p21、p27蛋白同源性在40%以上, p57、p21、p27共享一個N末端區, 以此結合并抑制周期蛋白-CDK復合物的激酶活性。它主要抑制 CCNE-CDK2、CCNE-CDK3、CCNA-CDK2、 CCND-CDK2等。G1期 和S期激酶復合物[27]阻 止 DNA合成和細胞進入S期來抑制細胞增殖。異常的啟動子甲基化修飾, 能導致p57基因沉默。研究表明, 與基因沉默相關的不是CpG島的邊緣區域, 而是轉錄起始位點周圍的區域(300~400 bp)密集甲基化[28]。 Kuang和他的同事[29]進行的一項研究發現, 在不同的白血病細胞系中, 有不同的啟動子甲基化狀態。在 p57基因啟動子甲基化的白血病細胞系中, p57過表達導致細胞生長顯著停滯和明顯的細胞凋亡, p57部分甲基化只導致細胞生長的適度抑制而對細胞凋亡沒有影響。這表明, p57的抑癌特性與其細胞的甲基化狀態相關。

　　3.1.5 p53 哺乳動物細胞在受到DNA損傷后, 細胞周期的進程將會停滯于兩個關鍵點, 即G1/S和G2/ M檢測點。抑癌基因p53主要在G1檢查點上發揮重要作用。p53作為重要的轉錄因子在DNA損傷、癌基因活化、應激等作用下, 一方面與下游靶基因的 DNA特異性結合來激活靶基因的轉錄, 另一方面激活的p53通過細胞周期和誘導細胞凋亡等方式防止腫瘤的發生。轉錄因子p53翻譯后要經過一系列復雜的加工與修飾, 最近研究發現, 甲基化修飾是p53 的活性調節方式之一, 對維持p53的活性與穩定性有極其重要的影響[30]。一個特定的、單一的賴氨酸甲基化就可以決定p53的活性, 其中, 轉錄因子p53羧基末端的K372位點被SET9甲基化可促進p53表達, 導致細胞周期阻滯甚至引起凋亡。有研究表明, p53產生的效應和甲基化位點相關, 如p53羧基末端K370 位點被甲基轉移酶Smyd2甲基化后, 會阻遏p53蛋白與DNA的結合, 抑制p53的轉錄[31]。此外, p53的活性還與該位點甲基化程度密切相關。在DNA復制過程中, DNA甲基轉移酶抑制劑通過與DNMTs共價結合, 抑制DNMTs的甲基化作用, 使沉默基因重新表達[32]。由于p53高頻率的遺傳修飾和功能的雙重性, 因此, 成為迄今為止最重要的腫瘤抑制因子。當 DNA損傷時, p53負責細胞周期阻滯。當損傷不能被修復時, p53會激活一系列導致細胞凋亡的事件。研究表明, p53基因在所有類型的白血病中高甲基化, 因此, p53可能是癌癥甲基化的潛在靶標[33]。

　　推薦閱讀：醫學論文準備技巧有哪些

　　p53基因對維持細胞的周期起重要作用。一方面, p53基因誘導產生的p21和Gadd45可與PCNA結合, 修復損傷的DNA; 另一方面, p53基因還可以通過與RPA結合而抑制RPA與DNA復制起始點的結合, 在G1后期調節DNA復制起始復合物的合成, 在S期對細胞進行負調控。

　　3.1.6 PENT 第10號染色體缺失性的磷酸酶及張力蛋白同源(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)基因位于人類染色體 10q23.3。PTEN是第一個發現具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因, 它通過對3,4,5-三磷酸肌醇(PIP3) 的去磷酸化作用來影響PI3K/Akt信號通道, 激活 Caspase-9及p27等蛋白活性, 抑制CDKs活性, 從而使細胞周期停滯在G1期, 引起腫瘤細胞的凋亡, 從而發揮其抗腫瘤作用[34-35]。高表達的PTEN能通過抑制CDK活性使Rb保持去磷酸化并結合E2F的狀態, 從而抑制細胞增殖。PTEN蛋白功能的缺失可導致 PI3K下游信號通路過度激活, 引起絲氨酸/蘇氨酸激酶和蛋白激酶B(Akt/PKB)堆積。