摘要 自組織工程與再生醫學概念提出以來, 組織工程與再生醫學特別是骨組織工程與再生醫學得到了突飛猛進的發展. 支架材料作為骨組織工程與再生醫學三要素之一扮演著至關重要的角色. 10余年來, 大量的研究工作圍繞支架材料展開. 納米生物材料尤其是無機納米生物材料, 具有優良的機械性能和生物相容性, 成為制備骨組織工程與再生醫學支架材料的理想選擇, 呈現出廣闊的應用前景. 本文對近年來無機納米材料, 包括羥基磷灰石、硅基納米材料, 含碳納米材料及幾種金屬納米材料在骨組織工程與再生醫學中的應用進行綜述.

　　關鍵詞 無機納米材料, 骨組織工程與再生醫學, 支架

　　在全球范圍內, 眾多骨損傷患者每年都遭受著病痛的折磨, 而造成骨損傷的原因很多, 如年齡、運動、疾病和創傷等. 自19世紀以來, 自體骨或異體骨材料體內移植一直是人們用來修復大面積骨損傷的方法, 然而這些材料自身就存在著不可忽視的缺陷. 自體骨移植雖易被患者接受, 但是會給患者造成新的創傷和痛苦, 異體骨材料雖然取材方便, 但是存在疾病傳播和免疫排斥的風險, 從生物安全上很難達到令人滿意的修復效果[1~3]. 骨組織工程與再生醫學在這種背景下應運而生, 給骨修復帶來新的期盼. 骨組織工程與再生醫學是通過“智能”操控種子細胞、支架材料和生長因子來模擬天然骨組織的微環境從而促進骨母細胞的增殖、分化及細胞外基質形成, 最終實現骨重建[4]. 其中支架材料是骨組織工程與再生醫學的關鍵, 同時也是研究力量投入最多的方向, 一方面其作為載體將種子細胞及生長因子運送至損傷部位, 另一方面支撐著新骨的生長. 目前, 在臨床治療中人工制備的材料用作硬組織修復材料越來越廣泛, 因此硬組織修復材料成為了臨床需求的最大領域之一, 而材料研發成為生物醫用材料發展最重要的一個方向. 理想的人工骨修復替代材料應具備以下特性[5]: (1) 優良的機械性能; (2) 良好的可加工性和臨床操作性; (3) 較好的生物學特性或可降解性; (4) 良好的骨傳導性和誘導性. 人工骨修復材料的發展按其演變歷程簡單分為3個階段[6]. 第1階段: 20世紀 60~70年代, 主要是第一代生物材料, 如部分骨衍生材料、金屬材料、生物陶瓷等, 這一代生物材料對宿主的應答較小; 第2階段: 20世紀80年代, 生物活性玻璃(Na2O-CaO-P2O5-SiO2)、羥基磷灰石(HA)等, 并研究出了生物體可吸收材料, 最終被再生出的組織替代, 如HA/聚乳酸(PLA)復合材料等. 第2代生物材料缺乏生物化學刺激的響應性, 因此降低了其使用功能, 縮短了其壽命; 第3階段: 20世紀90年代至今, 各類復合材料特別是無機復合材料取得了長足發展, 并且隨著納米學、材料學、細胞生物學、組織工程與再生醫學的發展和進步, 納米材料和仿生材料已經成為骨修復材料的主要發展趨勢.

　　納米骨修復材料是一類由人工合成、具有多種優良理化特性(如機械強度高、比表面積大等)和生物學特性(如生物相容性好、可降解、能誘導骨細胞和血管生長等)的新型骨修復材料. 近年來, 用于骨組織修復的主要有無機材料(羥基磷灰石、納米陶瓷、無機金屬等)、納米聚合物、納米仿生骨等. 其中, 無機材料因其具有強度好、加工方便、較好生物學特性等優點使其具有廣闊的應用前景[7~9]. 另外, 由于天然組織或者器官是通過細胞與納米尺度的細胞外基質相互影響而形成的, 那么納米材料的生物仿生性及生化特性對于促進細胞生長及誘導組織重建至關重要. 為了較好模擬細胞外基質的結構, 無機材料被設計成不同形貌, 如納米纖維、納米管、納米顆粒及水凝膠等, 用于細胞外基質的重組[10]. 本文以無機納米材料為重點, 詳細介紹了羥基磷灰石納米材料、硅基納米材料、碳納米材料及多種無機金屬納米材料在骨組織工程與再生醫學中的應用.

　　1 納米羥基磷灰石在骨組織工程與再生醫學中的應用

　　納米羥基磷灰石(nanohydroxyapatite, nHA)是天然骨骼中主要的無機成分, 是一種具有代表性的生物活性材料. nHA具有良好的骨傳導性、生物活性、骨結和性等特點成為良好的骨修復替代材料. 近10 年來, nHA作為人工骨材料在再生醫學領域中逐漸興起. 研究人員致力于改進nHA合成策略和加工方法, 使nHA的功能多樣化, 應用范圍廣泛化. 各種各樣的 nHA相繼出現, 如單一的nHA支架、nHA的復合材料等, 而研究這些材料的性能和應用成為當今的主題.

　　1.1 單一nHA支架

　　在骨組織工程與再生醫學中, 人們將HA做成不同結構的支架材料來研究其對蛋白吸附和細胞行為的影響. nHA的微孔和介孔結構, 為細胞外基質蛋白的吸附提供了可能的位點, 影響細胞在材料表面黏附和組織生成. Zhu課題組[11]研究表明多孔的nHA有利于低分子蛋白或轉錄因子的吸附, 特別是孔徑為 20 nm的nHA具有很強的纖維蛋白和胰島素吸附能力. 另外, nHA支架材料表面的粗糙程度對骨細胞的活性、黏附及分化也具有很大的影響. Iwamoto等人[12]通過將nHA和多聚物混合煅燒得到HA支架. 光滑材料表面由nHA聚集而成, 其晶格間距在微米級別; 而呈凹凸材料的表面由nHA聚集后煅燒得到, 晶格間距在納米級別. 骨細胞在光滑材料表面的黏附性能要顯著好于在凹凸表面. nHA的結晶度和溶解度也會影響吸附蛋白質的濃度、pH及介質的離子濃度. John等人[13]研究顯示, 低溶解度的nHA表面有助于成骨細胞(MG-63)的早期附著、貼壁和偽足延展. 而 β-磷酸三鈣則會在培養基中發生溶解, 導致培養基的低Ca, Mg和堿性磷酸酶(ALP)水平, 以及高P水平, 其表面的細胞也呈碎片化. 但隨著培養時間的延長, nHA和磷酸三鈣均產生抑制細胞遷移和生長的作用. 其原因可能是β-磷酸三鈣會快速溶解釋放出磷酸根和鈣離子, 而Ca2+則會再從培養基中沉淀到β-磷酸三鈣上, 從而導致磷灰石結晶度的相變. 另外, nHA的不同Ca和P的比例對成骨分化也有著顯著的影響. 通過酸刻蝕技術, 發現30%磷酸蝕刻可以有效地改變 Ca/P比, 并且可以加速成骨細胞MC3T3-E1的初始黏附, 增殖和分化[14]. 通過研究成骨細胞對普通nHA 和鈣缺陷nHA兩種材料的生物效應, 發現其對成骨細胞的活性和ALP的產生均有促進作用, 鈣缺陷nHA 的成骨分化能力要顯著高于普通nHA[15]. 單一nHA 支架的粒徑對骨細胞的生物學功能也起到重要的調控作用. Cai等人[16]研究不同粒徑的nHA對骨髓間充質干細胞(MSCs)和骨肉瘤細胞的影響, 結果表明 nHA促進MSCs的增殖、黏附, 抑制骨肉瘤細胞的生長, 尤其是尺寸為20 nm的顆粒作用效果最佳. 認為小粒徑的nHA顆粒更易于促進成骨細胞的黏附、增殖、分化及生物礦化, 進而加速骨的修復. 我們課題組通過水熱法合成了3種不同形貌和尺寸的缺陷發光 HA納米/微米粒子對小鼠原代成骨細胞(OBs)的生物效應, 發現其通過胞內和胞外兩條途徑共同作用促進OBs礦化. 短棒(直徑為25 nm, 長度為30~50 nm)和長棒(直徑為25 nm, 長度為70~110 nm)通過大胞飲和穴樣內陷途徑進入OBs, 定位于溶酶體, 在酸性環境下釋放出Ca2+, 為細胞礦化提供了Ca2+源. 而棒狀HA自組裝成的微米級刺球(直徑為5~6 μm)則無法進入細胞[17]. 不過細胞外的3種nHA顆粒均可以作為礦化核, 同樣促進原代成骨細胞的礦化.

　　為了模擬支架降解后產生的微小納米粒子對 BMSCs成骨分化的影響. 本課題組[18]合成出長約100 nm、寬約40 nm的長棒狀結構的nHA, 以模擬支架降解后產生的微小納米粒子對BMSCs成骨分化的影響. 研究發現nHA被細胞內吞后進入溶酶體, 在酸性環境中逐漸分解出磷酸根離子, 磷酸根離子進入到線粒體中與二磷酸腺苷(ADP)結合產生大量的三磷酸腺苷(ATP), ATP分解產物腺苷與膜上A2b腺苷受體結合激活腺苷酸環化酶(AC), 從而促進ATP轉化為環磷酸腺苷(cAMP), 最終激活環磷酸腺苷/蛋白激酶 (AcAMP/PKA)信號通路以促進BMSCs的成骨分化. 機理如圖1所示, nHA對骨分化分子機制的探討為其臨床應用提供了理論依據.

　　為了研究nHA對體內骨修復的作用, 研究工作者建立了系統、科學的分析方法用于評價nHA對骨細胞分化、骨修復及骨再生的能力. Zhu等人[19]建立了新西蘭大白兔雙橈骨缺損模型, 對比植入nHA材料和不植入組對骨修復的影響, 結果顯示, nHA的植入促進了骨愈合能力, 且在誘導骨性上有統計學差異. 另一個體內研究實例是將nHA和微米級別的HA移植到骨缺損位點, 3~12周后發現兩者誘導的骨形成和血管生成潛能與小梁骨相當, 沒有顯著性差異. 但是, 12周后移植nHA材料的部位可觀察到明顯的骨內生長. 上述研究證明nHA能夠模擬骨小梁, 在整形外科手術應用中具有巨大的潛力. 但是, 傳統單一的HA 機械性能較差, 主要表現在臨床應用中承載力低, 這便極大地限制了它的應用范圍[20].

　　1.2 HA/聚合物/細胞因子復合材料

　　傳統的HA具有機械性能差、脆性高、韌性差等缺點, 為了改善其力學性能, Bonfield等人[21]受到天然骨有機成分可增強無機成分機械性能的啟發, 最先提出了生物陶瓷/聚合物復合材料的概念, 在HA中摻入聚苯乙烯制備出類似骨基質的HA復合材料. 該材料顯著提高了HA的機械性能, 增加了韌性及生物活性. 另外, HA中摻入可降解聚合物, 如膠原纖維、蠶絲蛋白、聚乳酸、凝膠、殼聚糖等制備出的HA/復合材料已經進入臨床前期的研究階段. 每種聚合物的性能不同, 對于改善HA機械性能的程度也有所不同[22]. 膠原蛋白是天然骨組織中最豐富的聚合物蛋白, HA中摻入膠原蛋白為細胞提供更多的活性位點, 提升材料的可降解性, 進而加快新骨的再生. 然而, 由于膠原蛋白存在潛在的抗原性和病原體傳染性, 而且成本較高, 因此限制了它的應用范圍[23]. 明膠作為膠原蛋白的替代物, 具有多個整合素位點, 它沒有免疫原性, 對細胞的黏附起到關鍵作用. 此外, 支架材料上負載骨形態發生蛋白2(BMP2)和表皮生長因子等對于提高骨誘導性和局部血液運輸性能起到良好的促進作用[24~26]. 有學者提出鍶(Sr)元素可能在骨骼發育和骨修復中發揮重要作用[27~29], 近年來引起了眾多學者的興趣和關注. 目前, Sr被摻雜入許多生物活性材料中, 彌補了現有生物活性材料在成骨誘導性和降解性等方面的不足, 實現了骨修復生物材料的多功能性, 在骨組織工程與再生醫學中得以廣泛應用. Hao等人[30]采用化學沉淀法合成了一種粒徑在600~800 nm的鍶摻雜納米羥基磷灰石(nano-SrHA), 與nHA相比, 100 μg/mL nano-Sr-HAP (鍶/磷的摩爾比1.67)顯著增強了成骨細胞黏附、增殖和細胞活力, 而且增強了MSCs細胞的ALP活性, 是nanoHAP組的2.18倍, 證實鍶具有骨誘導的特性. 結果表明在納米羥基磷灰石中引入鍶元素后, 其性能得到明顯改善, 可以用于修復骨質疏松性骨折引起的骨缺損. 本課題組[31]之前采用仿生礦化的方法在聚乳酸多孔支架的表面沉積摻鍶的nHA(摻雜Sr的比率為 20%), 通過沉積Sr-HA有效改善聚乳酸的疏水性, 緩解聚乳酸降解產生的酸性, 并且通過摻入Sr來增加聚左旋乳酸(PLLA)的成骨性能, 其成骨性能為單一 PLLA的2.04倍(圖2).

　　生物陶瓷/生物聚合物復合材料具有較好的孔隙率, 較優的力學性能和生物特性是人工骨材料的理想選擇[32]. 近年來, 納米殼聚糖復合生物材料在組織工程與再生醫學應用引起廣泛的關注. 與單一的殼聚糖支架相比, nHA/殼聚糖復合支架的孔隙率高達95%, 孔徑為20~60 μm, 且具有良好的生物相容性[33]; 另外, nHA/殼聚糖復合材料具有良好的礦化能力, 表現在形成穩定的HA, 且促進細胞ALP的表達[34]. 文獻報道, nHA/殼聚糖纖維支架能夠誘導 BMSCs的成骨分化, 并促進MSCs的黏附和增殖, 在分子水平上, 上調成骨相關基因表達, 如I型膠原蛋白、ALP、骨鈣素、骨涎蛋白等基因[35]. Tang等人[36] 研究認為天然HA/殼聚糖復合材料能夠與硬骨組織很好地相容, 并誘導骨形成, 因此該材料作為骨組織工程與再生醫學中的人工骨移植物和支撐材料具有巨大潛力. 另外, Zhang課題組[37]利用靜電紡絲技術制備的HA/殼聚糖復合納米纖維具有類似天然骨纖維結構, 該材料摻入生物聚合物可提高材料的機械性能, 而nHA的摻入有助于成骨細胞的黏附和增殖. 體內研究同樣證明了nHA促進骨的形成與再生[38]. Fricain等人[39]對比摻雜或不摻雜nHA的具有直鏈結構的天然淀粉和葡聚糖的骨修復潛能. 結果顯示, 摻入nHA的復合物支架誘導形成磷灰石層, 有利于形成皮下致密組織、致密礦化物及骨移植位點早期骨的再生. 另一個異位移植的研究表明在功能化的多孔納米磷酸鈣/鈦合金支架上接種骨膜細胞, 并將其移植到骨缺損部位, 可以觀察到大量的新骨生成[40]. 除此之外, 將干細胞及生長因子與nHA預培養, 然后將其移植到兔顱骨缺損模型中, 結果發現, 經過移植 6和12周后觀察到29.45%和44.55%新骨區的形成. 因此, 將干細胞特別是人骨髓間充質干細胞(骨再生的金標準)預培養在nHA支架上能夠極大的提升骨再生, 并已經成功應用到臨床. 劉昌勝團隊[41]在鈣磷基納米材料上有著深厚的研究, 認為磷酸骨鈣水泥(CPC) 作為不同形式磷酸鈣的混合物同樣對骨修復行為有重要的影響. 劉昌勝課題組[42]報道了由無水磷酸四鈣和磷酸二鈣混合而成的CPC能夠與HA晶體形成水合物, 該材料具有較低結晶度和較高的水溶性, 使 CPC納米晶體具有較好的機械性能和較高的生物吸收性能, 促進相關成骨細胞體內礦化及HA/膠原蛋白基質的形成. 該團隊報道的CPC首次運用在國內臨床上. 此外, 該團隊的另外一項研究認為多孔β-磷酸三鈣(β-TCP)具有較好的生物相容性和骨傳導性, 但缺乏穩定的結構和機械性能, 限制了其在骨修復中的應用. 基于此問題, 該團隊將β-TCP與生物可降解 的聚乳酸(PLA)和聚己內酯(PCL)雜合形成β-TCP/ PGS介孔支架材料, 該支架具有多孔互通結構和較好的機械性能, 提高了相關骨細胞的穿透性、增殖能力及礦化能力.

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