【摘要】 目的 評價激活 α7 煙堿型乙酰膽堿受體對大鼠呼吸機相關肺損傷的影響。 方法采用隨機數字法將 32 只雄性 Sprague Dawley 大鼠分為：對照組(C 組)、機械通氣組(V 組)、煙堿預處理 + 機械通氣組(N 組)、甲基牛扁堿(MLA)+ 煙堿 + 機械通氣組(MLA 組)，每組 8 只。C 組大鼠氣管插管后不進行機械通氣，保留自主呼吸，其余各組大鼠機械通氣 2 h。N 組大鼠在機械通氣前 30 min 腹腔注射 1 mg / kg 的煙堿;MLA 組大鼠在腹腔注射煙堿前 30 min 先腹腔注射 1 mg / kg 的 MLA，其余各組大鼠腹腔注射等量等滲 NaCl 溶液。機械通氣結束后即刻處死大鼠，計算各組大鼠肺組織濕重 / 干重、蘇木素-伊紅(HE)染色、肺組織損傷病理學評分，并采用 Western-blotting 檢測白細胞介素 1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)蛋白表達水平。 結果 C 組大鼠肺泡形態結構正常;V 組大鼠肺泡形態結構破壞，大量炎癥細胞浸潤;N 組大鼠肺泡形態結構稍破壞，少量炎癥細胞浸潤;MLA 組大鼠肺泡形態結構破壞，肺泡萎陷，較多炎癥細胞浸潤。4 組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評分、IL-1β、IL-6 及 TNF-α 蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義 (F = 168.009、647.579、138.005、192.706、178.094，P 均 < 0.05)。進一步兩兩比較發現，V 組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評分、IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平均較 C 組更高(P 均 < 0.05);N 組大鼠濕重 / 干重、損傷評分、IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平均較 V 組明顯降低(P 均 < 0.05);MLA 組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評分、IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平均較 N 組明顯升高，差異有統計學意義(P 均 < 0.05)。 結論 煙堿對呼吸機相關肺損傷的大鼠模型具有保護作用，其機制與激活 α7-nAChR 有關。

　　【關鍵詞】 呼吸機相關肺損傷;α7-nAChR;大鼠

　　機械通氣是急性肺損傷和急性呼吸窘迫征的重要治療手段，盡管采用了小潮氣量的通氣策略，仍會引起部分肺泡組織的過度擴張，導致呼吸機相關性肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)[1-2]。VILI 的特點是肺泡上皮細胞和內皮細胞的通透性增加，以及肺組織的炎癥反應。研究表明，VILI 大鼠模型過量表達核因子 κB、白細胞介素 6(interleukin-6， IL-6)、IL-1β 等，這些炎癥細胞因子可進一步引起全身多器官功能障礙 [3-4]。α7 煙堿型乙酰膽堿受體(alpha7 nicotinic acetylcholine receptors，α7- nAChR)表達于巨噬細胞及上皮細胞，迷走神經分泌乙酰膽堿激活 α7-nAChR，來調節炎癥細胞因子的合成與分泌。迷走神經分泌乙酰膽堿來調節機體炎癥反應已經在膿毒血癥大鼠模型中被證實[5]。甲基牛扁堿(methyllycaconitine，MLA)是 α7-nAChR 特異性的阻斷劑，本研究中擬用 MLA 阻斷 α7-nAChR 來探討 α7-nAChR 在 VILI 大鼠模型中的作用，為臨床研究提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗動物及試劑

　　選取 32 只健康清潔的雄性 Sprague Dawley 大鼠(8 ~ 12 周齡，體質量 200 ~ 220 g)，購于南京大學模式動物研究所，飼養于揚州大學動物實驗中心，以常規飼料喂養，實行 12 h 晝夜循環。運用隨機數字分配的方法將 32 只實驗大鼠分為：對照組(C 組)、機械通氣組(V 組)、煙堿 + 機械通氣組(N 組)、 MLA + 煙堿 + 機械通氣組(MLA 組)，每組 8 只。

　　各組大鼠機械通氣前均禁食、禁水 12 h，腹腔注射 2%戊巴比妥鈉(20 mg / kg)進行麻醉，麻醉后備皮消毒，將 16 G 靜脈穿刺針插入大鼠氣管內作為氣管導管，接動物呼吸機(購于南京大學動物實驗儀器廠)進 行 機 械 通 氣 ，通 氣 參 數 為 ：潮 氣 量 8 ~ 10 mL / kg、通氣頻率 35 次 / min、吸呼比為 1 ∶ 1[6]。C 組大鼠氣管插管后不進行機械通氣，保留自主呼吸，其余各組大鼠機械通氣 2 h;煙堿及 MLA 均溶于 4 mL 等滲 NaCl 溶液中，N 組大鼠在機械通氣前 30 min 腹腔注射煙堿(1 mg / kg);MLA 組大鼠在腹腔注射煙堿前 30 min 先腹腔注射 MLA(1 mg / kg); C 組、V 組大鼠在造模前均腹腔注射等滲 NaCl 溶液 4 mL。煙堿、MLA 均購買于 Sigma 公司。本研究經醫院倫理委員會審核通過。

　　1.2 肺組織濕重 / 干重

　　各組大鼠通氣 2 h 后用頸椎脫臼法處死，取右上肺組織稱重(濕重)，然后置于 85 ℃烤箱中 72 h，稱重(干重)，計算肺組織濕重 / 干重[7-8]。

　　1.3 肺組織蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色與損傷評分

　　取各組大鼠右中肺組織，在 4%多聚甲醛中浸泡 24 h 后用石蠟包埋，制備 5 μm 厚的切片，進行常規 HE 染色。光鏡下觀察肺組織形態學改變并進行肺損傷評分，包括肺泡水腫、肺間質水腫、肺泡內充血和中性粒細胞浸潤(無改變或非常輕微為 0 分;輕度改變為 1 分;中度改變為 2 分;重度改變為 3 分;極重度改變為 4 分)[9]。

　　1.4 Western-blotting 檢測各組大鼠肺組織 IL- 1β、IL-6 及 腫 瘤 壞 死 因 子 α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)蛋白表達水平

　　取各組大鼠右下肺組織，按常規方法加入裂解液 400 μL [50 mM NaCl，10 mM Tris，1 mM 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)， 1 mM 苯 甲 基 磺 酰 氟 化 物 (phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)，0.5 mM 釩酸鈉，50 mM 氟化鈉，1 mM 苯甲脒，1 mg / L 抑肽酶]反復研磨。30 min 后，將裂解液移至 1.5 mL 離心管中，然后在離心器下以 12 000 r / min 離心 5 min，離心半徑 5 cm，取上層清液。通過二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白分析裝置測定各樣品蛋白濃度，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS) 配平并煮沸蛋白。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠，每孔蛋白上樣量 30 μg 后電泳，再用電轉移法將蛋白質從 SDS-PAGE 凝膠轉移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上，室溫下用 5%的脫脂奶粉封閉 1 h，分別加入抗鼠 IL- 1β(1 ∶ 1 000)，IL-6(1 ∶ 1 000)，TNF-α(1 ∶ 500)單克隆抗體，再加入抗兔二抗，孵育洗滌后采用增強化學發光法檢測這些蛋白，并用凝膠成像分析系統進行掃描分析[10]。

　　1.5 統計學方法

　　應用 SPSS 18.0 統計軟件進行統計學分析，計量資料用均數 ± 標準差(x軃 ± s)表示，各組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評分以及 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 蛋白表達水平比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 LSD 檢驗，以 P < 0.05 為差異具有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 各組大鼠肺組織 HE 染色結果

　　C 組大鼠見肺泡形態和肺泡間隔距離正常，肺泡腔內無滲出、出血，未見明顯炎癥細胞浸潤;V 組大鼠見肺泡結構明顯破壞，肺泡萎陷，肺泡內大量滲出，透明膜形成，肺泡內及肺泡間質大量炎癥細胞浸潤;N 組大鼠肺泡形態稍破壞，肺泡間隔基本正常，肺泡內少量滲出及出血，少量炎癥細胞浸潤;MLA 組見明顯肺泡結構破壞，肺泡間隔增大，較多肺泡萎陷，肺泡內及肺間質炎癥細胞較多，見圖 1。

　　2.2 各組大鼠肺組織濕重 / 干重及損傷評分

　　4 組大鼠肺組織濕重 / 干重及損傷評分比較，差異均有統計學意義 (F = 168.009、647.579，P = 0.001、< 0.001)。進一步兩兩比較發現，V 組大鼠肺組織濕重 / 干重及肺組織損傷評分均較 C 組明顯升高(P 均 < 0.05);N 組大鼠肺組織濕重 / 干重及肺組織損傷評分均較 V 組明顯降低(P 均 < 0.05);MLA 組大鼠肺組織濕重 / 干重及肺組織損傷評分均較 N 組明顯升高(P 均 < 0.05)，見表 1。

　　2.3 各組大鼠 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 蛋 白 表達水平

　　4 組大鼠肺組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平 比 較 ， 差 異 均 有 統 計 學 意 義 (F = 138.005、 192.706、178.094，P = 0.012、< 0.001、0.001)。進一步兩兩比較發現，V 組大鼠肺組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平均較 C 組更高(P 均 < 0.05);N 組大鼠 IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達水平均較 V 組明顯降低(P 均 < 0.05);MLA 組大鼠肺組織 IL-1β、IL-6、 TNF-α 蛋白表達水平均較 N 組明顯升高，差異有統計學意義(P 均 < 0.05)，見圖 2。

　　3 討論

　　本研究通過測定各組大鼠肺組織濕重 / 干重、 HE 染色及肺組織損傷評分發現，V 組大鼠肺組織濕重 / 干重較 C 組更高，肺間質廣泛水腫，肺泡腔出血，肺泡萎陷，肺組織被大量炎癥細胞浸潤，損傷更加嚴重，進一步提示 Sprague-Dawley 大鼠給予 8 ~ 10 mL / kg 的潮氣量可以用來構建 VILI 的動物模型進行相關研究;N 組大鼠肺組織濕重 / 干重較 V 組明顯減少，肺組織病理損傷明顯減輕，因此煙堿對 VILI 的大鼠模型具有保護作用;V 組與 MLA 組相比，我們還發現如果阻斷了 α7-nAChR，煙堿的這種保護作用將消失，提示煙堿對 VILI 大鼠模型的保護作用與激活 α7-nAChR 相關。

　　機械通氣可以引起廣泛的生物學應答，包括激活促炎細胞因子和細胞因子的級聯放大系統[11-12]。而且這些肺組織產生的促炎細胞因子和炎癥調節因子通過循環系統到達人體各個器官，引起多器官功能障礙[13]。Yang 等[14]在機械通氣的 Wistar 大鼠模型中發現，機械通氣后，大鼠肺組織中 IL-1β、TNF-α 含量明顯增加。Ma 等[1]研究發現，給予 Sprague-Dawley 大鼠 7 mL / kg 的潮氣量后，大鼠肺組織中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 過量表達。本研究與上述研究結果相一致。肺泡巨噬細胞在 VILI 中起關鍵作用，活化的巨噬細胞可以產生 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥細胞因子，引起肺損傷[15-17]。

　　α7-nAChR 主要表達于巨噬細胞和上皮細胞，煙堿結合并激活 α7-nAChR 可以抑制巨噬細胞產生和釋放 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥細胞因子。相反的，Wang 等[18]在 α7-nAChR 缺乏的野生小鼠模型中發現，電刺激迷走神經不能抑制 TNF 的合成，因此 α7-nAChR 在調節機體炎癥反應過程中起關鍵作用。Ma 等[19]在胰腺炎相關肺損傷的大鼠模型中證實，尼古丁激活 α7-nAChR 后，不僅能減輕胰腺組織的水腫壞死，也能顯著減輕肺組織的病理損傷，大鼠血清中 IL-6、髓過氧化物酶、TNF-α 等炎癥因子也明顯減少。He 等[20]在腸缺血再灌注肺損傷的 SpragueDawley 大鼠模型中發現，激活 α7-nAChR 可以通過抑制 Toll 樣受體 4 / 核因子 κB 信號通路減輕腸缺血再灌注導致的肺組織氧化應激以及炎癥反應。但是 α7-nAChR 在 VILI 中的作用仍有待研究。

　　本研究證實，激活 α7-nAChR 在 VILI 大鼠模型中起保護作用，可以減輕肺組織的病理損傷，并抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥細胞因子的表達。但是激活 α7-nAChR 通過何種分子信號機制來抑制炎癥細胞因子的表達，仍需進一步研究。

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