本研究從傳統發酵食品中篩選產脂肪酶乳酸菌，結合干酪漿快速成熟模型得到產內酯化合物性能較好的乳酸菌，將其作為附屬發酵劑應用于切達干酪的制備，采用感官評價、氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)聯用技術比較添加產脂肪酶乳酸菌的附屬發酵劑和未添加附屬發酵劑干酪在4、10、14℃成熟過程中(150 d)風味品質及內酯化合物含量的變化規律。結果表明，產脂肪酶乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3具有較好的產內酯性能。經感官評價發現，與未添加附屬發酵劑的切達干酪相比，添加乳酸片球菌4D的干酪在10、14℃成熟90 d時分別具有香氣強度最高的奶香味、果香;添加格氏乳球菌Y3的干酪在14℃成熟120 d具有最高的奶香味香氣強度值。利用GC-MS技術共鑒定出4種內酯類化合物，添加乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3的切達干酪在3種恒溫條件下成熟時，δ-癸內酯和δ-十二內酯的含量均高于未添加附屬發酵劑的切達干酪，且能夠促進δ-辛內酯的形成。此外，僅在格氏乳球菌Y3發酵的切達干酪中鑒定出γ-丁內酯。通過探究干酪成熟溫度和時間對內酯形成的影響，發現在14℃條件下干酪的成熟效果最好，添加乳酸片球菌4D的切達干酪在90 d時總內酯含量達到最高，添加格氏乳球菌Y3的切達干酪則是在120 d時達最高。

　　關鍵詞：乳酸菌;脂肪酶;切達干酪;內酯化合物;附屬發酵劑

　　論文《高產脂肪酶乳酸菌的篩選及其對切達干酪內酯類化合物形成的影響》發表在《食品科學》，版權歸《食品科學》所有。本文來自網絡平臺，僅供參考。

　　一、引言

　　切達干酪是以牛奶為原料，經濃縮、發酵等工序制成具有獨特風味的發酵乳制品[1]。對于消費者而言，切達干酪產品的風味品質是影響是否購買干酪產品的重要因素[2]。附屬發酵劑是指在干酪加工過程中除了添加主發酵劑乳酸菌外添加的一類可用于提高干酪風味品質或促進成熟的選定微生物[3]。乳酸菌因在發酵過程可產生乳酸促進凝乳便于排出乳清，還可通過碳水化合物代謝、脂肪酸代謝形成的醛、酮、內酯化合物賦予干酪奶香、果香風味而備受關注[4-5]。例如Gobbetti等[6]的研究表明，在切達干酪中附屬發酵劑可促進蛋白水解改善其風味品質。康優等[7]將乳酸片球菌(Pediococeus acidilaetici)AS185制成附屬發酵劑用于切達干酪的發酵成熟，與僅添加商業發酵劑干酪相比，添加附屬發酵劑的干酪具有更好感官屬性。

　　內酯類化合物在干酪中的含量較低，但其嗅覺閾值低，屬于干酪的關鍵風味化合物[8]。牛乳中的甘油三酯在脂肪酶的作用下分解成脂肪酸，并進一步通過β-氧化及環化生成γ-或δ-內酯類化合物[9]。利用微生物所產的脂肪酶改善產品風味可滿足消費者對食品天然、健康的需求，因此這種方式也備受關注[10]。如研究人員發現將米曲霉(Aspergillus oryzae)所產的脂肪酶與嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)等乳酸菌混合發酵，可顯著提高酸奶的風味品質[11]。洛克菲特青霉菌(Penicillium roqueforti)所產的脂肪酶在藍紋干酪成熟過程中能夠提高干酪的質量、外觀與風味[12]。產脂肪酶微生物還能夠在不影響產品的理化性質情況下促進干酪的成熟[13]。但不同微生物所產脂肪酶在酶學特性上存在差異[14]，因此探究干酪的加工參數(如溫度、成熟時間)對于利用微生物改善干酪風味十分重要。目前，國內外研究學者發現瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillus casei)在干酪成熟14 d時可促進其中苯甲醛、乙偶姻的形成[15]。在成熟60 d時，經副干酪乳酪桿菌、發酵乳桿菌發酵的干酪中乙酸、己酸乙酯、苯乙醇含量較高[16]。

　　切達干酪的成熟過程以及風味的穩定形成耗時較長，因此國內外學者通常建立干酪漿快速成熟模型以實現快速準確評價干酪成熟過程中的風味品質變化[17-18]。干酪漿體系能夠加速干酪的成熟，如Boran等[19]利用干酪漿加速了干酪的成熟，并實現干酪風味的改善。這一加速過程是由于干酪漿具有較高的含水量和成熟溫度(30℃)，從而加快體系內微生物的生化代謝[20]。干酪漿快速成熟模型也可用于評估乳酸菌在干酪發酵過程的作用，如李春燕等[21]利用干酪漿快速成熟模型篩選出具有較好蛋白水解能力的附屬發酵劑乳酸菌。

　　由于缺乏優質的產脂肪酶乳酸菌資源及其對切達干酪內酯化合物貢獻尚不明晰，因此有必要篩選高產脂肪酶乳酸菌，開發相應的附屬產香發酵劑，并探究工藝參數對干酪風味調控的影響。基于此，本研究利用三丁酸甘油酯透明圈法結合銅皂法從不同發酵樣品中篩選高產脂肪酶乳酸菌，對其生長特性進行分析。進一步制作干酪漿快速成熟模型探究不同高產脂肪酶乳酸菌的產內酯類化合物性能，篩選產內酯能力較高的菌株，通過感官評價和氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術解析高產脂肪酶乳酸菌及其在不同成熟時間與溫度條件下對切達干酪內酯類化合物的貢獻，以期為開發改善切達干酪內酯類風味的附屬發酵劑以及促進我國干酪產業發展提供理論參考。

　　二、材料與方法

　　2.1 材料與試劑

　　巴氏殺菌乳購自光明乳業股份有限公司;由乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp. lactis)和乳酸乳球菌乳脂亞種(L. lactis subsp. cremoris)組成的Choozit MA 14 LYO發酵劑購自美國國際香精香料公司。乳餅為云南大理市售;臭豆腐鹵水為上海浦東新區市售;奶疙瘩為新疆烏魯木齊市售;奶豆腐為內蒙古阿拉善盟市售。

　　MARZYME MT2200凝乳酶(米黑根毛霉Rhizomucor miehei酸性蛋白酶，酶活力≥2200 IMCU/g)購自美國國際香精香料公司;MRS肉湯培養基購自北京陸橋技術股份有限公司;正構烷烴(C?~C??)(色譜純)購自美國Sigma-Aldrich公司;2-辛醇(分析純)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;吐溫-80、司盤-80(均為分析純)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DNA抽提試劑盒、脂肪酶活性檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

　　2.2 儀器與設備

　　Veriti96聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)儀購自美國Applied Biosystems公司;Bio 5000Plus電泳凝膠成像分析系統購自上海中晶科技有限公司;TGL-16M紫外-可見分光光度計購自上海尤尼柯儀器有限公司;DC1741型干酪小型制備機購自上海承歡輕工機械有限公司;DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維頭購自美國Supelco公司;7890B-5977B型GC-MS儀購自美國Agilent公司。

　　2.3 方法

　　2.3.1 培養基的配制

　　- 三丁酸甘油酯培養基的配制：100 mL體積分數為10%的三丁酸甘油酯、蛋白胨10 g、牛肉粉3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、900 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，121℃滅菌20 min。

　　- 產酶培養基的配制：20 g橄欖油乳化液(稱取1.4 g吐溫-80，加入13.2 g去離子水中，邊加邊攪拌均勻，再于80℃水浴溶解至溶液透明后取出，加入4 g橄欖油和1.4 g司盤-80，用均質機處理20 min至混合液呈乳白色的均勻乳狀液，需現用現配)、蛋白胨10 g、牛肉粉10 g、酵母粉5 g、硫酸鎂0.1 g、醋酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸錳0.05 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

　　2.3.2 高產脂肪酶乳酸菌的分離篩選與鑒定

　　- 產脂肪酶乳酸菌的初篩：在無菌條件下，從4種傳統發酵食品(乳餅、臭豆腐鹵水、奶疙瘩、奶豆腐)中分離出外觀形態不同的單菌落，劃線純化后用30%甘油保存于-80℃。參考李曉楠等[22]的方法并稍作修改，在三丁酸甘油酯平板上打直徑為0.8 cm的小孔，精確量取100 μL菌液接種于小孔，置于37℃的培養箱中培養48 h，觀察平板上是否出現透明圈，通過測量不同菌株所形成透明圈的直徑，初步評估菌株產脂肪酶能力。

　　- 產脂肪酶乳酸菌的生物學鑒定：將產脂肪酶菌株的單菌落接種于MRS瓊脂培養基，37℃培養24 h，觀察并記錄菌落的大小、形態等特征。挑取單菌落進行過氧化酶實驗以及革蘭氏染色并鏡檢，記錄菌體形態。對產脂肪酶菌株進行16S rDNA序列鑒定，采用基因組DNA抽提試劑盒提取菌體DNA，PCR擴增引物為27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR擴增條件：95℃預變性10 min;94℃變性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸90 s、72℃后延伸5 min，30個循環，最后4℃保存。PCR擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所得16S rDNA的測序結果利用NCBI數據庫中的Blast比對分析，將與待鑒定的基因序列同源性大于99%(相似度>99%認定為同一個種[23])的16S rDNA序列使用MEGA11軟件構建系統發育樹。

　　- 高產脂肪酶乳酸菌的復篩：測定初篩得到產脂肪酶乳酸菌的脂肪酶活力，篩選高產脂肪酶乳酸菌。將產酶乳酸菌接種于MRS培養基中，置于37℃培養至波長600 nm處的OD值=1.0。隨后以2%的接種量分別接種到10 mL產酶培養基中，37℃培養24 h，得到對應的發酵液。取1 mL發酵培養液在7000 r/min、4℃條件下離心10 min，收集上清粗酶液。按照脂肪酶活性檢測試劑盒說明書測定，按式(1)計算脂肪酶活力：

　　[脂肪酶活力 /(U / mL)=frac{A}{t} × F quad (1)]

　　式中：A為待測樣品在710 nm波長處的吸光度;t為催化反應的時間/min;F為發酵液的稀釋倍數。

　　2.3.3 高產脂肪酶乳酸菌的生長特性評價

　　- 高產脂肪酶乳酸菌耐酸性評價：活化后的高產脂肪酶乳酸菌置于37℃培養至波長600 nm處的OD值=1.0，以2%的接種量分別接種于pH 5.0和pH 6.0的MRS肉湯培養基中，每隔3 h測定不同pH值條件下的OD?????。

　　- 高產脂肪酶乳酸菌耐鹽性評價：活化后的高產脂肪酶乳酸菌置于37℃培養至波長600 nm處的OD值=1.0，以2%的接種量分別轉接于含不同質量分數(2%、3%和5%)NaCl的MRS肉湯培養基中(2%、3%為制備切達干酪通常的NaCl用量[24]，考慮到鹽分布的均勻性及極端情況下NaCl的質量分數會達到5%[25-26]，故將該條件納入)。于37℃恒溫培養箱內培養24 h，每隔3 h測定菌株在不同NaCl含量MRS肉湯培養基中的OD?????以評價乳酸菌的耐鹽性。

　　- 乳酸菌的自溶度測定：以磷酸鹽緩沖液為對照，測定菌體懸液和對照在37℃條件下培養24 h的OD?????。按式(2)計算菌體的自溶度：

　　[自溶度 / \%=frac{OD_{0}-OD_{24}}{OD_{0}} × 100 quad (2)]

　　式中：OD?為初始的OD值;OD??為培養24 h后的OD值。

　　2.3.4 附屬發酵劑的制備

　　取生長特性較好的高產脂肪酶乳酸菌接種于10 mL MRS肉湯培養基中，37℃恒溫培養至波長600 nm處的OD值=1.0。按2%的接種量轉接于50 mL產酶培養基中，37℃恒溫培養24 h后取上述發酵液到離心管中，在4℃、10000 r/min條件下離心10 min，沉淀物用質量分數0.85%生理鹽水洗滌2次，最后將菌泥重懸于0.85%生理鹽水中得到附屬發酵劑菌液。

　　2.3.5 干酪漿快速成熟模型的制作

　　參考郭婷等[20]的方法。巴氏殺菌乳水浴加熱至30℃后測定pH值(pH?)，然后向巴氏殺菌乳中加入1%(質量分數)的商業發酵劑(乳酸乳球菌乳亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種)，并在30℃條件下發酵，在發酵過程中測定pH值(pH?)，當pH?與pH?間差值大于0.4時，向其中加入1.5%(質量分數)的凝乳酶，攪拌混勻后靜置40 min。等待巴氏殺菌乳凝固后，將其切割成豆腐乳樣形狀，并在切割過程中繼續水浴加熱，以0.2℃/min的速率升溫至38℃，待析出乳清的pH值降至6.15時，排出乳清并保持溫度為38℃，當凝乳凝結成塊后將其切割成30 cm×30 cm×30 cm的塊狀。每隔15~20 min翻轉1次，重復3次，待排出的乳清pH值降至5.45時完成凝塊的堆積，得到干酪凝塊。隨后取100 g干酪凝塊裝入無菌真空袋中，對照組加入50 mL質量分數為5%的滅菌NaCl溶液，實驗組加入47 mL質量分數為5%的滅菌NaCl溶液和3 mL附屬發酵劑菌液(乳酸菌濃度為10×10? CFU/mL，添加量0.8%)攪打成漿狀，真空密封完成干酪漿快速成熟模型的制作。在30℃恒溫環境中成熟1、3、6、9、12 d。根據干酪漿中內酯化合物的含量，篩選出產內酯性能較好的高產脂肪酶乳酸菌。

　　2.3.6 切達干酪的制備

　　參考本課題組前期建立的方法[3]。巴氏殺菌乳打入干酪罐中并加熱至31℃，記錄此時的pH值，分別加入質量分數1%發酵劑(乳酸乳球菌乳亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種)和附屬發酵劑(乳酸菌濃度為1×10¹? CFU/mL，添加量0.8%)，并設置未添加附屬發酵劑的對照組，隨后在31℃條件下發酵30 min，待殺菌乳pH值與發酵前相比下降0.4時加入質量分數1.5%凝乳酶，攪拌后凝乳40 min。隨后將凝塊切割成邊長為1 cm的方塊，切割過程中以0.1℃/min的速率熱燙至39℃，隨后將干酪罐蓋上蓋子使溫度維持在39℃，待析出乳清的pH值為6.15時排出乳清，將凝乳切割成30 cm×30 cm×30 cm的方塊。干酪塊堆積在一起，每隔15 min翻轉1次，重復3次。待析出乳清的pH值為5.45后將凝乳塊切成1 cm×1 cm×1 cm的方塊。隨后將質量分數2.5%的NaCl溶液均勻撒到切達干酪上并進行攪拌，入模型壓榨成型并真空包裝，分別放于4、10、14℃(10~14℃有助于加快干酪的成熟[3,30])恒溫條件成熟30、60、90、120、150 d(切達干酪的成熟期為2~36個月[30-31])。

　　2.3.7 干酪的感官評價

　　由20名經感官品評培訓的評價員組成評價小組(女性10名、男性10名，平均年齡24歲)。所有的感官測試按照國際標準ISO 8589:2007在感官實驗室中執行，室內溫度控制在20℃。待測試的干酪樣品用數字隨機編碼，每個干酪樣品切成大小均勻的顆粒并稱取5 g，分別保存在一個有蓋的、無氣味的玻璃容器中(總容量為50 mL)。然后，按隨機順序排列，依次呈送給評價員進行感官評價測試。感官評價員按照評價表上的屬性和定義對每個干酪樣品進行評分，所采用的描述詞與參考標準分別為奶香味(0.002%的丁二酮溶液)、果香味(0.002%的己酸乙酯溶液)、硫味(搗碎的雞蛋殼)、酸腐味(0.1%的丁酸溶液)、堅果味(生堅果)、干酪味(新鮮黃油)。在干酪香氣感官評價中，每個香氣屬性以0~10進行強度等級劃分(0為無強度或香氣無察覺，5為中等強度，10為非常強)。每個干酪樣品重復檢驗3次。

　　2.3.8 干酪的GC-MS分析

　　采用頂空固相微萃取法對干酪中內酯類化合物進行提取。分別精確稱量5.0 g干酪樣品，碾碎后放入萃取瓶中，加入100 μL 220 mg/L的2-辛醇溶液，在60℃的恒溫水浴鍋中平衡5 min，通過DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭在60℃條件下萃取45 min。采用HP-INNOWAX色譜柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm);進樣口溫度250℃。程序升溫：40℃保持3 min，以5℃/min的速率升至140℃，保持2 min，3℃/min升至240℃，保持15 min。載氣為氦氣(純度為99.99%);流量為2 mL/min;進樣方式為不分流進樣。

　　質譜條件：電子轟擊能量：70 eV;離子源溫度：230℃;四極桿溫度：150℃;發射電流：35 µA;掃描速率：1.9 scans/s;質量掃描范圍m/z 30~450。所有揮發性化合物的定性采用NIST17質譜庫進行檢索，選擇匹配度大于80%的物質確定化合物。再利用正構烷烴C?~C??計算保留指數(retention index, RI)，并與文獻報道值進行比對，兩者結合對干酪內酯類化合物進行定性分析。采用內標法進行定量分析，分別按式(3)、(4)計算各組分含量和RI：

　　[內酯類化合物含量 /(mg / kg)=frac{ ho_{0} × V_{0}}{m} × frac{S_{a}}{S_{0}} quad (3)]

　　式中：ρ?為內標物的質量濃度/(mg/L);V?為內標物的體積/L;m為樣品質量/kg;S?為待測化合物的峰面積;S?為內標物的峰面積。

　　[RI=100 × n+100 × frac{RT-RT_{n}}{RT_{n+1}-RT_{n}} quad (4)]

　　式中：RT為化合物的保留時間/min;RT?和RT???分別為碳數n和n+1正構烷烴的保留時間/min(RT?

　　2.4 數據處理

　　每個實驗重復3次，采用Excel 2019軟件整理實驗數據，以±s表示。采用SPSS 26.0軟件對數據進行顯著性分析，利用Origin 2019b軟件繪圖。

　　三、結果與分析

　　3.1 高產脂肪酶乳酸菌的篩選

　　三丁酸甘油酯平板上培養物周圍出現透明圈表明該培養物可產生降解三丁酸甘油酯(C?)中短鏈底物的脂肪酶，因此該方法常用于脂肪酶生產菌的篩選[32]。本研究采用三丁酸甘油酯透明圈法從乳餅、臭豆腐鹵水、奶疙瘩、奶豆腐中篩選出33株具有透明圈形成能力的培養物。將初篩培養物經劃線純化后在MRS瓊脂平板上的菌落形態呈白色或乳白色，菌落較小且呈圓形，邊緣光滑。經過過氧化氫酶實驗與革蘭氏染色得到10株過氧化氫酶陰性與革蘭氏染色陽性菌。

　　將菌株的16S rDNA序列上傳至NCBI數據庫進行Blast比對，選取相似性大于99%的菌株序列，使用MEGA11軟件將其與分離菌株進行多序列比對，構建系統發育樹。結果顯示，菌株Y3、Y2為格氏乳球菌(L. garvieae)，4X、42、6為戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，4D、2為乳酸片球菌(P. acidilactici)，31、43、30為植物乳植桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)。

　　隨后利用銅皂法對初篩具有產脂肪酶能力的乳酸菌所產脂肪酶的活性進行測定，結果顯示，從云南、新疆、內蒙古等主要牧民生活地區發酵乳制品所分離的戊糖片球菌6、戊糖片球菌4X、乳酸片球菌4D、乳酸片球菌2所產脂肪酶具有相對較高的活力，其中乳酸片球菌4D酶活力最高，達3.32±0.54 U/mL，格氏乳球菌Y3酶活力為1.46±0.27 U/mL。

　　3.2 高產脂肪酶菌株的生長特性分析

　　3.2.1 耐酸性與耐鹽性分析

　　研究菌株生長環境中NaCl含量與pH值對其生長的影響情況對于切達干酪的制備具有重要意義。在切達干酪成熟過程(60~180 d)中的pH值范圍通常在5.0~6.0之間[33]。在pH 5.0、6.0的MRS培養基中，6株產脂肪酶乳酸菌均可正常生長。在2%、3% NaCl溶液環境中6株產酶乳酸菌均能夠正常生長;當NaCl質量分數達到5%時，格氏乳球菌Y2和戊糖片球菌6的生長受到抑制。這表明格氏乳球菌Y3、乳酸片球菌2、戊糖片球菌4X和乳酸片球菌4D能夠較好適應常規以及非常規切達干酪的環境，也可用于干酪漿快速成熟模型的制作，從而進一步評估菌株在干酪中的應用潛力。

　　3.2.2 菌株的自溶度分析

　　菌株的自溶度是影響干酪質量和口味的重要因素，它可以幫助細菌產生胞內酶，從而改善干酪的風味[34-35]。戊糖片球菌4X、格氏乳球菌Y3、乳酸片球菌4D、乳酸片球菌2的自溶度均大于15%。研究表明，菌株的自溶度大于15%能夠快速釋放胞內酶進行代謝反應，從而促進風味化合物的形成[36-37]。綜合不同產脂肪酶乳酸菌的耐酸耐鹽特性，選擇戊糖片球菌4X、格氏乳球菌Y3、乳酸片球菌4D、乳酸片球菌2用于建立干酪漿快速成熟模型，分析其產內酯能力。

　　3.3 基于干酪漿快速成熟模型的高產脂肪酶乳酸菌產內酯化合物性能分析

　　在干酪漿的12 d成熟期內，由不同產脂肪酶乳酸菌發酵的干酪漿中內酯總含量在成熟的第3天到第9天迅速增加，在成熟后期又緩慢增加;乳酸片球菌4D發酵成熟的干酪漿中總內酯含量(181.88 μg/kg)高于其他不同產酶乳酸菌發酵干酪漿，且是對照組樣品(71.25 μg/kg)的2.6倍，格氏乳球菌Y3發酵的干酪漿中總內酯含量(157.75 μg/kg)是對照組的2.2倍。在5組干酪漿樣品中均鑒定出δ-癸內酯和δ-十二內酯;在乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3發酵的干酪漿中還鑒定出δ-辛內酯，第12天的含量分別為25.78 μg/kg和39.71 μg/kg;僅在格氏乳球菌Y3發酵的干酪漿中鑒定出γ-丁內酯(84.1 μg/kg)。本研究發現乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3能夠豐富干酪漿快速成熟模型中的內酯化合物種類與含量，具有促進內酯風味形成的潛力，因此選擇這兩株乳酸菌進一步探究產脂肪酶菌株對切達干酪產品風味的影響作用。

　　3.4 不同高產脂肪酶乳酸菌所制備干酪的感官評價

　　干酪的成熟溫度與成熟時間會改變菌株的代謝活動，從而影響干酪的風味品質[38-39]。通過對分別添加了2株產脂肪酶乳酸菌和未添加產脂肪酶乳酸菌的干酪香氣進行感官評價，探究其在4、10℃和14℃條件下成熟30、60、90、120、150 d的風味變化情況。感官評價結果表明乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3發酵干酪樣品的風味強度隨時間的延長、溫度的增加而逐漸增強。在10、14℃成熟90 d時，添加高產脂肪酶乳酸菌4D和Y3干酪樣品的奶香味和果香味均高于對照組，且在14℃條件下添加乳酸片球菌4D干酪的奶香味和果香味強度值達到最高，分別為7.9和7.4。而含有格氏乳球菌Y3的干酪在14℃成熟120 d時，具有最高的奶香味香氣強度，為7.9。在成熟150 d時，不同成熟溫度下的干酪風味強度均降低。

　　3.5 不同成熟時間和溫度下高產脂肪酶乳酸菌所制備干酪的內酯類化合物分析

　　添加2種高產脂肪酶乳酸菌以及未添加高產脂肪酶乳酸菌的切達干酪在150 d成熟周期中內酯化合物種類以及含量變化顯示，通過NIST 17.0譜庫與RI共檢出4種內酯類化合物，包括δ-癸內酯、δ-十二內酯、δ-辛內酯和γ-丁內酯。δ-癸內酯是切達干酪中最為常見的內酯化合物，賦予干酪椰子的風味屬性[40]。對照組干酪的δ-癸內酯含量最高達106.05 μg/kg，添加乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3的干酪最高分別可達245.33、353.24 μg/kg。δ-十二內酯通常賦予干酪奶油以及奶香的風味，已有研究表明其是干酪中的關鍵風味化合物[41]。δ-十二內酯在對照組成熟過程中含量最高達44.58 μg/kg，添加乳酸片球菌4D與格氏乳球菌Y3的干酪中δ-十二內酯的最高含量分別為108.85、77.17 μg/kg。δ-辛內酯也是干酪中的主要內酯，其對干酪的風味有重要貢獻，能夠賦予干酪椰子的風味屬性[42-43]。添加乳酸片球菌4D與格氏乳球菌Y3的干酪在成熟前60 d即可檢測到δ-辛內酯，而對照組在成熟90 d后才能夠檢測出。此外，僅在添加格氏乳球菌Y3的干酪樣品中檢測到γ-丁內酯，其可貢獻椰子味和奶油味的風味屬性[44]。綜上，產脂肪酶乳酸菌能夠提高干酪中內酯化合物的含量與種類，且在所篩選的兩株高產脂肪酶乳酸菌中，格氏乳球菌Y3所發酵的干酪含有較高含量的內酯化合物與種類，因此其具有的產內酯性能更好。

　　影響切達干酪中內酯化合物形成的因素包括溫度、水分、附屬發酵劑以及原料乳的預處理方式[45]。本研究探究了不同成熟時間和溫度對干酪樣品中內酯化合物形成的影響。結果表明，在4~14℃成熟120 d時，切達干酪中的δ-癸內酯含量最高，δ-辛內酯與δ-十二內酯均在成熟90 d時檢測到最高值，且內酯含量隨成熟溫度的提高而提高。γ-丁內酯在4~10℃成熟150 d時含量達最高(24.52~38.45 μg/kg)，而在14℃成熟90 d時可達到最高(54.25 μg/kg)。可見，較高的成熟溫度能夠促進內酯化合物的形成。此外，在14℃成熟120 d后干酪中內酯化合物含量逐漸降低或積累變慢。因此，較高的成熟溫度雖然對干酪內酯風味具有積極影響，但成熟時間不宜過長。綜上，選擇產脂肪酶乳酸菌Y3發酵干酪，且在14℃成熟120 d適于干酪內酯化合物的形成。

　　四、討論

　　切達干酪中的內酯類化合物是牛乳中甘油三酯在脂肪酶的作用下形成脂肪酸，進一步在β-氧化酶、環化酶的作用下形成，對干酪整體風味具有重要貢獻[46]。研究發現，產脂肪酶乳酸乳球菌乳亞種(雙乙酰型)(L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis)能夠提高干酪中脂肪酸的含量[47]。因此，將產脂肪酶乳酸菌作為附屬發酵劑與商業發酵劑混合可作為調控干酪內酯類化合物生物合成的策略。干酪漿快速成熟模型因具有較高的含水量與成熟溫度，可用于快速評估附屬發酵劑乳酸菌的風味形成潛力[17]。此外，探究成熟溫度及時間對切達干酪風味形成的影響已成為一個熱點[3,28,48]，但目前對于產脂肪酶乳酸菌與切達干酪內酯化合物之間的相關性鮮有報道。本研究基于三丁酸甘油酯平板、銅皂法和干酪漿快速成熟模型篩選適用于制備切達干酪、具有較好產內酯能力的高產脂肪酶乳酸菌并制備附屬發酵劑，結合感官評價與GC-MS探究含高產脂肪酶乳酸菌的附屬發酵劑以及不同成熟溫度與時間對切達干酪內酯化合物形成的影響。

　　脂肪酶能夠催化甘油三酯的水解從而形成切達干酪的風味前體——游離脂肪酸，通常外源添加的脂肪酶適用于原料乳，因此利用附屬發酵劑在干酪發酵過程中產生脂肪酶，可避免因原料乳熱處理引起的酶失活[49]。乳酸菌是脂肪酶的來源之一，如Esteban-Torres等[49]發現植物乳植桿菌所產的脂肪酶能夠降解三丁酸甘油酯。本研究從發酵乳制品所分離的戊糖片球菌6、戊糖片球菌4X、乳酸片球菌4D、乳酸片球菌2具有相對較高的脂肪酶活力。李曉楠等[22]結合三丁酸甘油酯平板透明圈法以及銅皂法從新疆地區發酵乳制品中篩選出高產脂肪酶的植物乳植桿菌、瑞士乳酸桿菌(L. helveticus)。此外，從臭豆腐鹵水分離出的格氏乳球菌Y2、格氏乳球菌Y3所產的脂肪酶活性也相對較高。有研究表明臭豆腐鹵水中含有較多微生物所產生的脂肪酶[50]。目前研究的產脂肪酶菌株主要是從土壤、污水等環境中篩選分離[51-52]，本研究結果為食源產脂肪酶乳酸菌的篩選提供了新的參考。

　　干酪漿快速成熟模型與切達干酪在NaCl添加量方面存在差異，前者的NaCl添加量通常在5%，切達干酪中的NaCl質量分數在2%~4%[24,27]。結合不同NaCl濃度下的生長曲線，發現格氏乳球菌Y3、乳酸片球菌2、戊糖片球菌4X和乳酸片球菌4D在5%的NaCl環境下能夠生長，因此可應用于干酪漿快速成熟模型。干酪漿快速成熟模型能夠縮短干酪的成熟周期[17-19]。Kristoffersen等[27]發現干酪漿在30℃成熟3 d后，可形成切達干酪的獨特風味。將格氏乳球菌Y3、乳酸片球菌2、戊糖片球菌4X和乳酸片球菌4D應用于干酪漿快速成熟模型，發現在干酪漿12 d的成熟期中，內酯化合物含量從第3天開始迅速增加。這一加速過程是由于干酪漿具有較高的含水量和成熟溫度，從而加快體系內微生物的生化代謝[27]。但有研究表明，這種高溫、高水分的環境會影響體系中的化學反應和酶催化反應以及增加微生物腐敗等風險，因此干酪漿快速模型更適合篩選特定的微生物[53]。另一方面，乳酸菌的自溶與風味密切相關，如Drake等[54]通過促進發酵劑菌株的自溶改善干酪品質。乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3的自溶度與其他菌株相比相對較高，這可能與其較好的產內酯性能相關。

　　附屬發酵劑的添加對切達干酪的感官評分與風味形成具有重要的影響[38]。將干酪漿快速成熟模型篩選出產內酯性能較好的乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3制成附屬發酵劑，并應用于切達干酪的制備，發現添加高產脂肪酶乳酸菌4D和Y3干酪樣品具有更濃郁的奶香味和果香味。添加乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3提高了切達干酪中δ-癸內酯、δ-十二內酯的含量，且縮短了δ-辛內酯的形成時間，只有格氏乳球菌Y3在成熟過程中形成γ-丁內酯。研究表明，乳球菌能夠促進脂肪分解并有效改善干酪風味[55]。李宇輝等[56]發現產脂肪酶乳酸菌附屬發酵劑能夠改善干酪的感官品質，促進具有奶油味、果香味的風味化合物形成。因此產脂肪酶乳酸菌能夠改善切達干酪的風味感官，促進內酯類化合物的形成。

　　成熟溫度對切達干酪的風味也有影響[43]。切達干酪中的內酯化合物含量隨成熟溫度的提高呈上升趨勢，其中14℃相比其他2種溫度能夠加快內酯化合物的形成，如γ-丁內酯在4~10℃成熟150 d時含量達到最高，而在14℃成熟90 d即可達到最高值。這可能是由于干酪中微生物菌群的代謝酶活性被激活，從而促進微生物代謝產香[57-58]。Walsh等[30]發現10℃成熟8個月與7℃成熟12個月的干酪感官品質相似，較高的成熟溫度能夠促進干酪風味的形成，這與本研究結果一致。另一方面，成熟時間對內酯的積累具有重要作用，Alewijn等[59]發現γ-內酯類化合物需要更長的成熟時間才能達到最高濃度，這與本研究中γ-丁內酯的積累趨勢一致。王姣等[48]對不同成熟周期切達干酪的揮發性化合物分析發現，切達干酪中內酯化合物的含量隨成熟時間的延長緩慢增加。Chen Chen等[8]對英國威克農場切達干酪的內酯化合物進行分析，發現δ-辛內酯、δ-癸內酯以及δ-十二內酯在早期至成熟階段迅速積累，隨后緩慢變化。在添加產脂肪酶乳酸菌附屬發酵劑的切達干酪中，這3種內酯化合物在成熟90~120 d達到最高值，隨后逐漸下降。但對于內酯化合物與切達干酪的成熟標志之間相關性，還需通過風味指紋圖譜技術結合多元統計方法進一步分析判斷。

　　五、結論

　　本研究利用三丁酸甘油酯透明圈法、銅皂法并結合干酪漿快速成熟模型篩選得到耐酸耐鹽性與產內酯性能較好的乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3。將乳酸片球菌4D和格氏乳球菌Y3作為附屬發酵劑用于切達干酪的制備，研究發現添加這兩株菌的切達干酪中內酯化合物種類與含量均提高，且改善了切達干酪的感官屬性。格氏乳球菌Y3能夠促進切達干酪γ-丁內酯的形成，且在14℃成熟120 d的效果較好，在切達干酪的附屬發酵劑開發方面具有良好的應用潛力。后續研究可進一步測定干酪成熟過程中脂肪酸含量的變化，以探究乳酸菌所產脂肪酶在內酯化合物形成過程中的作用以及內酯化合物的形成與切達干酪成熟的相關性。

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