摘要：目前，小分子藥物研究已經進入平臺期，而大分子生物藥物迅速發展起來。糖藥物作為生物藥中尤為重要的一類，被廣泛應用于腫瘤、心腦血管疾病等的預防和治療。然而無論骨架糖鏈還是修飾性糖鏈，都具有結構復雜且微不均一性的特點，這對現代分析技術提出了較高的要求。隨著軟電離技術、多級質譜技術的發展以及分辨率和靈敏度的提高，質譜技術已被廣泛應用于糖類藥物的分析和表征。對糖藥物、質譜技術進行了簡要的介紹，并以多糖藥物和糖綴合物類藥物為例闡述了質譜在糖藥物結構表征方面的技術進展，此外還就質譜在糖藥物新藥及仿制藥物研發和注冊方面的應用進行了討論。

　　關鍵詞：質譜;糖藥物;結構表征

　　21世紀以來，隨著經濟的發展，人們生活水平迅速提高，醫療條件大幅改善，傳統傳染性疾病如瘧疾、麻疹等的發病率逐年下降。同時，由于環境的污染與不合理的生活方式，以癌癥、糖尿病、心腦血管疾病等為代表的現代非傳染性疾病的發病率與死亡率正逐年攀升。現代疾病的復雜性和多樣性對藥物先導化合物的種類提出了更高的要求。糖藥物作為一類重要的生物大分子藥物，因其分子量大、結構復雜等特點而遠遠滯后于小分子藥物的發展。但近年來，隨著分析技術的發展，大量以糖類為先導化合物的新藥被發現，糖類藥物也因此成為了繼蛋白質類藥物后另一個潛力無限的新藥寶庫。如2018年7月治療阿爾茨海默癥的新藥“甘露寡糖二酸”順利完成Ⅲ期臨床試驗，這標志著該藥的研發已邁過了最為關鍵的一步，也表明糖類作為一類新的先導化合物在未來藥品的研究中發揮著不可替代的作用[1]。

　　1 糖藥物與質譜技術

　　廣義的糖藥物是指以糖結構為骨架或以糖結構為修飾的藥物。包括僅含糖分子的“多糖類藥物”(如肝素、甲殼素等)，作為多數藥用植物活性成分的“糖苷類藥物”(如強心苷、黃芪皂苷等)，以糖蛋白、糖脂為代表的“糖綴合物類藥物”(如單克隆抗體、人胎盤脂多糖等)，非酶糖基化反應得到的“擬糖復合物”(如糖疫苗等)[2]。區別于小分子藥物，糖藥物的復雜性給其定性定量及安全性與療效的評估帶來了巨大的挑戰，如多糖類藥物中的低分子肝素具有高負電荷、分子量大、結構不均一等特征[3]，糖綴合物類藥物中的單克隆抗體具有復雜的糖基化修飾，包括糖基化位點及糖型的多樣性[4]。傳統分析方法如高效液相色譜法難以對糖藥物復雜的組分實現基線分離，對分離組分的結構解析也相對困難。紅外光譜法能對部分官能團進行歸屬，然而所能獲得的結構信息有限。核磁共振波譜法盡管能獲得較為全面和細致的結構信息，但其只能表征整體結構而無法鑒定單個組分。而具有其他分析方法無可比擬的優點的液相色譜串聯質譜法(LC-MS)將液相良好的分離能力和質譜高分辨率、高靈敏度結合，可以完成對糖藥物各組分及其碎片分子量的測定，從而實現對其精細結構的表征。

　　質譜分析是一種通過測量離子質荷比(質量與電荷之比)從而確定質量進而推算分子結構的分析方法。質譜儀由進樣系統、離子源、質量分析器和檢測器等部分組成，其中離子源和質量分析器是核心部分。離子源包括軟電離和硬電離兩類。在糖藥物分析中廣泛使用的是軟電離方式，如電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)和基質輔助激光解析電離(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)[5-6]。質量分析器可分為高分辨與低分辨兩類。由于糖藥物結構的復雜性，高分辨的質量分析器如軌道阱質量分析器(orbitrap)和飛行時間質量分析器(time of flight, TOF)等被廣泛應用于其結構的分析。通過軟電離源與高分辨的質量分析器，可以確定糖藥物組分的精確分子量，從而計算其糖單元組成和數量、取代基情況等。如果需要對糖鏈的結構進行更深入的鑒定，如糖鏈的連接順序、連接位點、分支情況和取代基的具體位置等，則需要用到多級質譜。在多級質譜中，通過碰撞誘導解離(collision induced dissociation, CID)、電 子 轉 移 解 離(electron-transfer dissociation， ETD)及高能碰撞解離(higher-energy collisional dissociation, HCD)等不同碎裂方式使特定的母離子碎裂，再對碎裂得到的子離子進一步解析，可實現糖類藥物的序列測定和同分異構體的區分等。此外，三重四極桿質量分析器(triple quadrupole)所 特 有 的 多 反 應 監 測 模 式(multiple reaction monitoring, MRM)通過過濾背景離子可顯著提高定量的選擇性和準確度，適用于糖藥物關鍵組分的定量分析。由于質譜技術可以很方便地與氣相色譜和液相色譜等技術實現聯用，更加促進了其在糖藥物分析中的應用。

　　2 質譜在糖藥物結構表征方面的技術進展

　　2 .1 質譜在多糖類藥物結構表征方面的技術進展

　　多糖類藥物根據所帶電荷可分為帶正電荷的多糖(如甲殼素)、帶負電荷的多糖(如肝素、硫酸軟骨素和透明質酸等糖胺聚糖)以及中性多糖等。肝素(圖 1)是最具有代表性的多糖藥物，其全球市場規模超過 120 億美元 / 年。肝素由己糖醛酸(β-D- 葡萄糖醛酸或 α-L- 艾杜糖醛酸)和葡萄糖胺通過 1-4 糖苷鍵連接形成的二糖重復單元連接而成。己糖醛酸可能會發生 2-O- 硫酸化，而葡萄糖胺可能會發生 6-O- 硫酸化、3-O- 硫酸化、N- 硫酸化及 N- 乙酰化。肝素作為抗凝血藥物具有超過 80 年的臨床使用史，為了提高其生物利用度、降低臨床副作用，之后又出現了各種低分子量肝素藥物。依據降解工藝的不同，低分子肝素可分為依諾肝素鈉、達肝素鈉、那曲肝素鈣、帕肝素鈉和汀肝素鈉等。不同的低分子肝素品種具有各自的結構特征及臨床適應證。

　　由于低分子肝素的組成和結構十分復雜，往往需要用到多種質譜技術從不同的角度對其進行分析，常用的策略包括自上而下分析(top-down)和自下而上(bottom-up)分析(圖2)。自上而下的分析指不經降解處理直接對低分子肝素進行液相色譜質譜分析，如Linhardt實驗室開發了一種基于親水相互作用色譜(HILIC)與質譜聯用的方法分析低分子肝素的完整糖鏈指紋圖譜，解析了各糖鏈組分的鏈長、末端結構、硫酸基和乙酰基的取代數目等，并根據質譜信號強度計算各組分的相對含量[7]。筆者課題組開發了反相離子對色譜質譜聯用的方法，對依諾肝素鈉和那曲肝素鈣分別進行了完整糖鏈的分析，共鑒定到140多種依諾糖鏈結構和80多種那曲糖鏈結構，還可以靈敏地檢測到產品中的副反應產物[8]。利用多級質譜技術，還可以實現對低分子肝素中糖鏈的直接測序[9]。自下而上的分析是指通過酶解或化學降解的方法把低分子肝素充分降解成基本的二糖組成單元或部分降解成寡糖片段，再用液相色譜質譜法進行分析。由于質譜既可以檢測到沒有紫外吸收的組分，又可以發現沒有對照品的新結構，可以鑒定到的低分子肝素衍生二糖或寡糖的數目遠遠超過以往的認識。目前最全面的質譜分析方法可以鑒定并定量約50種依諾肝素鈉的基本組成單元[10]。從肝素酶II降解的低分子肝素寡糖片段混合物中，也可以鑒定并定量超過40種寡糖片段，這些寡糖片段可以作為評價多糖序列的間接證據[11]。

　　2.2 質譜在糖綴合物類藥物結構表征方面的技術進展

　　在糖綴合物類藥物中，糖蛋白藥物是尤為重要的一類。在糖蛋白藥物中，最具代表性的是以γ型免疫球蛋白G(IgG)為基礎的單克隆抗體類藥物。單克隆抗體(圖3)是由兩條輕鏈及兩條重鏈通過二硫鍵連接組成的四聚體，其中每個輕鏈由一個可變區(VL)和一個恒定區(CL)組成，而每條重鏈由一個可變區(VH)和3個恒定區(CH1、 CH2和 CH3)組成。連接兩條重鏈的鉸鏈區經水解后可分為含有抗原結合位的Fab區和易結晶的Fc區[12]。大部分單克隆抗體的Fc區CH2處的Asn297氨基酸殘基上有一個N-糖基化位點，此處的糖基化修飾位于兩個CH2之間，由于空間限制了其糖鏈分支的延伸，故該處最常見的糖型為雙天線結構并大多伴有核心巖藻糖基化。約20%的單克隆抗體會在Fab區存在另外一個N-糖基化位點，如西妥昔單抗的CH1處 Asn88氨基酸殘基上就發生了N-糖基化[13]。另外單克隆抗體還可能發生O-糖基化修飾[14]。

　　由于單克隆抗體包括蛋白質主體和糖鏈修飾兩部分，對其全面的結構表征包括對蛋白質的表征和對糖的表征。蛋白質的全譜分析包括 ：蛋白質分子量的測定(完整分子量及輕鏈、重鏈的分子量)、氨基酸序列的測定、二硫鍵的位置及蛋白質空間的結構等[15-17]。對糖的表征包括糖基化位點的鑒定(N- 糖基化位點和O-糖基化位點)及糖型的表征。N-糖基化位點的鑒定可以借助糖苷酶，如采用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切割糖苷鍵時，會留下一個GlcNAc 殘基附著在蛋白質上，使肽段增加203Da的質量標簽[1 8]。而使用肽-N-糖苷酶(PNGase)在D2O中釋放完整糖鏈，會同時將天冬酰胺殘基轉化為天冬氨酸殘基，使肽段增加3Da的質量標簽[19]。隨后使用 LC-MS/MS分析檢測去糖基化后的質量差異，就可以確定原始N-糖基化發生的位點。不同于N-糖基化位點，O-糖基化的發生位點難以預測，原因是O-糖鏈的核心結構具有異質性，目前還沒有通用的內切糖苷酶被發現，導致其鑒定相對困難。Bai等[20]采用混合外切O-糖苷酶，部分移除O-糖肽絲氨酸和蘇氨酸上的糖鏈，并留下一個GalNAc殘基作為質量標簽，然后利用LC-MS/MS檢測203Da的質量差異來確定O-糖基化位點。糖型的分析策略包括使用 PNGase 酶釋放糖鏈、固相萃取富集純化糖鏈、熒光標記和液相質譜聯用檢測等步驟。如H enry等[21]報導了采用這一策略對曲妥珠單抗的糖型的分析。

　　3 質譜在糖藥物新藥及仿制藥研發和注冊方面的應用

　　3. 1 質譜在新型糖藥物研發中的應用

　　人們對糖分子結構與功能的認識遠遠落后于核酸和蛋白質等生物大分子。近年來，隨著分析技術的進步，尤其是質譜技術的發展為開發新型糖藥物提供了有力的保證。巖藻糖化硫酸軟骨素是近年來發現的一種重要的具有新藥前景的多糖，可以作為肝素類抗凝藥物的補充。這種多糖存在于海洋動物海參中，其抗凝機制與肝素不同，為抑制內源凝血通路，通過質譜等技術可以鑒定這種糖鏈的基本結構[22]。而通過尖端的離子回旋共振質譜技術，可以更為精細地鑒定這類新型糖鏈的精細結構[23]，從而為其成藥性研究提供結構基礎。

　　蛋白質組學技術，尤其是糖組學技術，是質譜在新藥研究領域中的另一個重要應用。人體內超過 50%的蛋白質會發生糖基化修飾，而與疾病發生發展密切相關的生物標志物蛋白的糖基化比例往往更高。基于質譜技術的糖組學分析可以比較病人與健康人樣本間的差異，從而發現生物標志物糖蛋白，提供新藥開發的靶點[24]。除了結構鑒定外，質譜還可以用于大分子的空間相互作用分析。如Li等[25]利用氫氘交換質譜技術分析了不同單克隆抗體對腫瘤標志物糖蛋白糖基化修飾的不同響應及相關的抗原表位，有助于指導單克隆抗體藥物的深入優化。

　　3.2 質譜在糖藥物仿制和報批方面的應用

　　由于糖鏈的不均一性，在糖藥物仿制藥的結構一致性評價時，很難采用小分子化學藥物的分析方法。通常需要更多地使用各種質譜技術，盡可能全譜表征其整體結構和各糖鏈組分結構。以低分子肝素為例，2010年，Sanofi公司的依諾肝素鈉專利到期，隨后美國的Sandoz公司成功仿制了這一品種，并借助質譜等分析技術證明了其仿制藥與原研藥在結構上的一致性。美國FDA就這一事件出臺了低分子肝素仿制藥一致性評價的指導意見，強調了應對產品的完整糖鏈分布、二糖基本組成單元、寡糖指紋圖譜和糖鏈序列等方面進行細致的結構確證和比較。而滿足這些結構分析要求，質譜技術是不可或缺的[26]。單克隆抗體等糖綴合藥物的仿制和評價需要遵循生物相似性(biosimiliar)原則[27-29]。對于糖鏈修飾部分，需要通過質譜技術來表征糖基化位點和糖型并與原研藥進行比較。

　　4 總 結

　　隨著現代疾病的復雜化和多樣化，局限來源的先導化合物已經不能滿足人們對疾病的預防和治療的需求，糖藥物作為一類新的先導化合物在未來人類疾病治療中起到不可或缺的作用。中國生物醫藥企業想要搶占藥物產業升級的先機，就應重視糖藥物的研發和仿制。結構鑒定和表征是糖藥物研發的一個瓶頸，而質譜技術，尤其是糖的質譜分析，需要非常強的專業性。因此建設專業化的糖分析質譜平臺，培養更多的相關專業人才，建立更多的糖分析相關標準，將有利于推動我國糖產業的技術變革和優化升級。

　　期刊推薦：《質譜學報》(雙月刊)創刊于1980年，由中科院北京科學儀器研制中心主辦。刊登物理、化學、生物化學、材料學、核科學、地球科學、生命科學等基礎學科中質譜法的新理論、新方法、新技術及其在各領域的應用研究成果，同時介紹質譜學及其相關技術在上述前沿課題研究中的最新進展。