摘要:探討糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，DCM)中各級血管的病理改變，對炎癥、纖維化、凋亡等病理因素在其中的作用和特點進行深入的研究，以確定更為有效相關的血管損傷與保護病理評價指標。選用雄性C57BL/6小鼠40只，隨機分為正常對照(Control)組、DCM組。采用高糖高脂飼料喂養聯合腹腔注射鏈脲佐菌素構建DCM小鼠模型，模型建立成功12周后通過HE染色、Masson染色、免疫組織化學法、免疫熒光法、TUNEL染色法，EVG染色法等方法觀察血管的結構病變、纖維化及膠原纖維collagenI，collagenIII堆積情況、巨噬細胞和中性粒細胞炎性浸潤程度，檢測心臟組織中的細胞凋亡及血管壁彈力纖維環的破壞情況。DCM各級血管結構病變顯著，血管壁增厚(P<0.01)，纖維化顯著加重(P<0.01)，炎性細胞聚集浸潤。膠原纖維中collagenI，collagenIII均在血管壁明顯增加，其中以collagenIII更為顯著;炎性細胞巨噬細胞特異性標記分子CD68、中性粒細胞特異性標記分子Ly6G顯示兩種炎性細胞均明顯增多(P<0.01)，其中巨噬細胞增加更為明顯且在血管壁大量浸潤(P<0.01);DCM血管彈力纖維環紊亂，不連續，DCM中細胞的凋亡顯著增加(P<0.01)，但特異性發生于血管上的細胞凋亡并不明顯。結論DCM中血管病變嚴重，是病變心臟組織中纖維化最明顯、炎性細胞浸潤為最嚴重的部位。血管壁結構紊亂，但與特異性發生于血管的細胞凋亡相關性不大，炎癥反應和纖維化是其主要的損傷因素。其中，纖維化以collagenIII增加最為顯著，炎性細胞對血管的直接浸潤以巨噬細胞為主。因此，膠原纖維collagenIII和巨噬細胞浸潤強度可作為DCM血管損傷與保護的有效評價指標。

　　關鍵詞:糖尿病心肌病;血管損傷;炎癥;纖維化;凋亡;病理特征

　　尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者在排除高血壓和冠心病的前提下，出現的心臟結構改變和功能障礙，即使在血糖控制良好的糖尿病患者中亦有將近75%的發病率，是糖尿病患者發生心衰和導致死亡的主要原因[1]。因此，對DCM病理改變和特點的研究，有利于闡明其發病機制，并為糖尿病患者實施心臟手術和體外循環時保護策略的優化以及特異性保護藥物的研發，提供客觀高效的病理評價方式和指標。長期高血糖對心肌組織和各級血管的損傷是DCM病理改變中最為主要且相互關聯的兩個方面[2]。但是，目前DCM的研究主要集中在炎癥、凋亡、纖維化等病理因素造成心肌損傷的特點和機制，而這些因素對血管病理改變的影響和作用特點則尚未完全闡明[3-5]。本實驗通過構建DCM模型，重點關注DCM中各級血管中的炎癥、凋亡、纖維化等主要病理特點，探索更為精準的血管損傷與保護評價指標，為DCM血管損傷機制的研究和臨床相關保護策略提供理論基礎和新的探索思路。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　成年雄性C57BL/6小鼠，體重20～25g，均由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，高糖高脂飲食(美國Dysts公司)，原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒(Roche公司)，DAPI染液(美國Sigma公司)，戊巴比妥鈉(北京索萊寶有限公司)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

　　1.2方法

　　1.2.1實驗分組將40只成年雄性C57BL/6小鼠隨機分為2組:①正常對照組(Control組):持續正常飲食喂養，4周時注射和DCM造模組相同劑量不含STZ檸檬酸鈉緩沖液;②DCM組:持續高糖高脂飲食喂養，第4周時連續3天腹腔注射鏈脲佐菌素(streotozotocin，STZ，溶于pH=4.5檸檬酸鈉緩沖液中)60mg/kg·d-1，1周后測空腹血糖，血糖值≥11.1mmol/L即為造模成功。

　　1.2.2心肌HE染色迅速取出心臟，以預冷的PBS沖洗干凈，然后置于4%(質量分數)多聚甲醛固定24h。經脫水、包埋后，垂直于心臟長軸將其切成5μm厚的切片，進行蘇木精-伊紅染色。普通光鏡下拍照并觀察各級血管損傷情況。

　　1.2.3心肌細胞凋亡指數檢測迅速取出心臟，以預冷的PBS沖洗干凈，經多聚甲醛溶液中固定后進行石蠟包埋切片。常規脫蠟至水后，嚴格按照TUNEL試劑盒說明書要求操作。

　　1.2.4免疫組織化學染色迅速取出心臟，以預冷的PBS沖洗干凈，經多聚甲醛溶液中固定后進行石蠟包埋切片，切成5μm厚的切片。將心臟組織切片進行膠原蛋白I和膠原蛋白III的免疫組織化學染色。將切片用稀釋的0.1%(質量分數)牛血清白蛋白封閉30min;將切片用抗collagenI(1∶200，體積比)和collagenIII(1∶1000，體積比)抗體在4℃孵育過夜;用0.1mol/LPBS洗滌3次后，切片與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗在37℃孵育30分鐘。用0.1mol/lPBS洗滌3次后，通過用DABHRP底物試劑盒(Vectorlab，Burlingame，CA，USA)顯色來檢測collagenI和collagenIII表達情況。

　　1.2.5免疫熒光染色迅速取出心臟，以預冷的PBS沖洗干凈，經多聚甲醛溶液中固定后進行石蠟包埋切片，切成5μm厚的切片。將切片用稀釋的0.1%(質量分數)牛血清白蛋白封閉30min;輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內4℃孵育過夜;用0.1mol/LPBS洗滌3次后。滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min;用0.1MPBS洗滌3次后，DAPI染液，避光室溫孵育10min;用0.1MPBS洗滌3次后，用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于OlympusFV10C-W3激光共聚焦顯微鏡(Olympus，Japan)下觀察并采集圖像。

　　1.2.6EVG染色(Verhoeff’sVanGieson，EVG)迅速取出心臟，以預冷的PBS沖洗干凈，經多聚甲醛溶液中固定后進行石蠟包埋切片，切成5μm厚的切片。將切片放入v(酒精蘇木素)∶v(三氯化鐵)∶v(碘液)5∶2∶2混合成的EVG染液中，染30min，自來水沖洗;三氯化鐵分化液稍分化一下，自來水洗一下，如此反復操作，在顯微鏡下控制分化程度，至彈力纖維呈紫黑色，背景呈灰白色近無色;將v(飽和苦味酸)∶v(酸性品紅)9∶1混合成VG染液，染1～3min，快速水洗，無水乙醇三缸快速脫水。用干凈的二甲苯透明1～5min，中性樹膠封片。普通光學顯微鏡下鏡檢，觀察各級血管形態結構變化。

　　1.2.7統計學處理實驗結果數據均以均值±標準差(x±s)表示，采用Prism5.0軟件進行統計學分析，以t檢驗分析兩組間的差異顯著性，P<0.05為具有統計學差異。

　　2結果

　　2.1DCM中各級血管形態結構病變嚴重并發生纖維化

　　DCM小鼠心臟血管HE染色顯示，與Control組相比，各級血管結構紊亂，血管壁明顯增厚(圖1(c)，P<0.01)，炎性細胞聚集浸潤(圖1(a));Masson染色顯示糖尿病心肌病中，心肌組織中和血管纖維化顯著加重(圖1(b)，圖中藍色染色部分;圖1(d)，P<0.01;圖1(e)，P<0.01)，而血管周圍的纖維化程度較心肌中又顯得更為嚴重(P<0.01)。

　　2.2DCM血管膠原纖維堆積，collagenIII尤為顯著

　　DCM組心臟血管膠原纖維collagenI與collagenIII免疫組化顯示，膠原纖維collagenI在血管周圍和心肌組織間隙中均有分布，與Control組相比有所增加，但并不顯著，且以伴隨血管壁增厚而增加為主(圖2(a));DCM組膠原纖維collagenIII主要分布在心臟血管及周圍，較Control組增加顯著。

　　2.3DCM炎性細胞明顯增加，血管周圍以巨噬細胞浸潤為主

　　DCM小鼠心臟炎性細胞巨噬細胞特異性標記分子CD68與中性粒細胞特異性標記分子ly6G分別與非特異性的細胞骨架微絲蛋白β-actin雙標免疫熒光顯示，與Control組相比，DCM組中炎性細胞不論是巨噬細胞還是中性粒細胞均明顯增加(圖3(c)，P<0.01;圖3(d)，P<0.01;圖4(c)，P<0.01)，而其中以巨噬細胞的增加尤為顯著(圖3(a)，黃色與白色箭頭指向處;)，并且在血管壁的分布聚積的密集程度(圖3(a)，白色箭頭指向處)遠較心肌組織中高(圖3(a)，黃色箭頭指向處;圖3(e)，P<0.01);中性粒細胞在DCM中亦明顯增加(圖4(c)，P<0.01黃色箭頭指向處)，但較巨噬細胞增加幅度相對較小，且分布相對隨機，并未出現在血管壁額外的富集浸潤(圖3(b))。

　　2.4DCM血管彈力纖維紊亂變形，特異性發生于血管的細胞凋亡并不顯著

　　EVG染色顯示，Control組血管壁結構完整有序，管壁厚度適中，彈力纖維連貫(黑色箭頭指向處)。然而，DCM組則可見明顯的血管壁結構紊亂，完整性破壞，彈力纖維斷裂(圖4(a));TUNEL凋亡染色顯示DCM中，凋亡細胞較正常組明顯增加(圖4(d)，P<0.01)，但凋亡細胞的分布亦相對的隨機，未見在血管的特異性分布增加。

　　3討論

　　DCM是糖尿病患者的主要嚴重并發癥之一，是造成糖尿病患者死亡的主要原因。檢測其病理改變對于闡明其發病機制，指導和制定臨床上糖尿病患者心臟手術時的體外循環等保護策略均具有重要意義。現有研究表明，高血糖狀態下誘發的炎癥、凋亡、纖維化是造成血管和心肌組織損傷和病變最為主要的因素，但目前對繼發病理因素在DCM血管病理損傷中的作用特點缺乏較全面的研究[2，4，6-8]。因此，深入研究和探討炎癥、凋亡、纖維化等因素在DCM血管病理改變中的作用特點，對于精準評價DCM的發生發展程度尤為重要。

　　血管壁增厚、結構紊亂、炎性細胞聚集以及纖維化，是DCM血管病理改變中最為顯著的特點[2，4]。在研究中，DCM組心臟血管同樣明顯觀察到了以上特征，從側面驗證了實驗模型的成功，同樣證明了這些病理變化在DCM血管病變中的關鍵性。在對纖維化的觀察和分析中，我們發現纖維化程度在DCM的心肌組織和血管中都明顯加重，而血管周圍及血管壁的纖維化程度比心肌組織中更為嚴重。DCM中血管結構和功能破壞、血管管腔狹窄、血栓形成機率增加、血液運輸能力下降、血管壁氧/二氧化碳交換受阻，是最終導致心臟功能障礙的重要原因。

　　膠原纖維collagenI，collagenIII是DCM中改變最為明顯的膠原纖維類型[9-11]，為進一步研究DCM中血管膠原纖維堆積的特點，本研究通過免疫組化的方法對這兩類膠原纖維的分布和改變進行觀察。發現膠原纖維collagenI在心肌組織間隙和血管壁均有較廣泛的分布，而膠原纖維collagenIII則主要分布血管中。與Control組比較，DCM組心臟collagenI，collagenIII均有所增加，兩者在血管壁的增加均較心肌組織更為明顯，其中以collagenIII在血管壁的堆積最為突出。由此說明，血管是DCM纖維化病理改變和損傷最為敏感的組織，而膠原纖維collagenIII的堆積是其主要特征。

　　炎癥反應，包括炎性細胞的浸潤與炎性因子的釋放等，在DCM的病理改變中亦發揮著重要的作用。其中，巨噬細胞和中性粒細胞是機體局部參加炎性浸潤、吞噬壞死細胞和病菌、釋放炎性因子最為主要的炎性細胞[10，12-14]。為進一步探討這兩種炎性浸潤細胞在DCM血管損傷炎癥反應中的作用和特點，本研究分別對巨噬細胞特異性標志物CD68、中性粒細胞特異性標志物ly6G與細胞骨架蛋白β-actin實施免疫熒光雙標法，確定其數量變化和位置分布特點。發現在DCM組中，兩種炎性細胞的數量較正常組均明顯增多，其中中性粒細胞的增加幅度相對較小，且分布隨機，未見在血管周圍的特異性分布增加;而巨噬細胞的增加尤為明顯，且在血管壁中的分布密集程度較心肌組織更高。由此進一步提示在DCM的病理性炎癥反應中，血管是炎性細胞最先浸潤且較為嚴重的組織，而這種浸潤以巨噬細胞為主。

　　為了對DCM血管結構的病理破壞程度進行更深入和直觀的了解，本研究的創新點在于對心臟的血管彈性纖維環和結構實施EVG染色。發現正常組各級血管管壁薄厚均一，結構完整，較大血管有一層位于血管壁內側的彈性纖維環，分布連貫;而DCM組的血管壁則明顯增厚，厚薄不一，結構紊亂，彈性纖維環參差斷裂。為進一步確定DCM中嚴重的心臟各級的血管損傷是否與血管壁上細胞凋亡增加有關，又對DCM中細胞的凋亡進行了進一步的觀察。細胞凋亡增加是DCM的重要病理改變之一，且在糖尿病小鼠的胸腹主動脈病變中亦觀察到了相同的情況[15-16]。實驗發現，與正常Control組比較，DCM組心臟中凋亡的細胞明顯增加，但呈現出隨機分布，未見血管壁上額外的增加和密集。提示DCM中心臟嚴重的血管損傷與血管壁上細胞的凋亡無明顯相關性，而炎性細胞浸潤和纖維化是其損傷的主要原因。

　　綜上所述，本實驗發現，DCM的心臟各級血管病理改變明顯，尤其是炎性細胞浸潤和纖維化程度較心肌組織更為嚴重。其中，血管壁纖維化膠原堆積以collagenIII最為顯著，炎性細胞對血管的浸潤以巨噬細胞為主。可見，collagenIII、巨噬細胞不僅可以作為DCM血管纖維化及炎性浸潤程度的評價指標，而且還能夠依據collagenIII的堆積和巨噬細胞的浸潤程度來客觀的評價臨床受治病人或動物藥效學實驗的療效。

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