摘　要 ：本試驗(yàn)利用膠體金免疫層析技術(shù)原理，研制了布魯氏菌抗體檢測試紙條，并以布魯氏菌陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了敏感性試驗(yàn)，確定了最低檢出量，同時(shí)與有可能存在交叉反應(yīng)的血清和陰性血清進(jìn)行了特異性試驗(yàn);然后將保存不同時(shí)間的試紙條在進(jìn)行了敏感性和特異性試驗(yàn)，證明其穩(wěn)定期可以達(dá)到 15 個(gè)月。選擇臨床牛羊血清 30 份，利用該試紙條與布魯氏菌病虎紅平板試驗(yàn)抗原進(jìn)行同步檢測，發(fā)現(xiàn)兩種試劑的檢測符合率為 98%。試驗(yàn)證明，所研制的布魯氏菌抗體檢測試紙條敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定期長。

　　關(guān)鍵詞 ：布魯氏菌 ;脂多糖 ;膠體金 ;免疫層析 ;金黃色葡萄球菌 A 蛋白

　　布 魯 氏 菌 病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)侵入機(jī)體，引起傳染變態(tài)反應(yīng)性的人獸共患細(xì)菌性傳染病 [1] 。本病發(fā)現(xiàn)至今已有 130 多年歷史，不僅沒有被消滅，近年來還有逐年上升的趨勢。該病分布廣泛，在全世界范圍內(nèi)流行。布魯氏菌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)須通報(bào)動(dòng)物疫病，為我國二類動(dòng)物疫病 [2] 。布魯氏菌能感染人、多種家畜和野生動(dòng)物，引起發(fā)熱、流產(chǎn)、睪丸炎、關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損傷等臨床癥狀，嚴(yán)重危害人類健康與畜牧業(yè)發(fā)展，并且威脅公共衛(wèi)生與食品安全，在國際貿(mào)易檢疫中為必檢傳染病之一 [3] 。

　　布魯氏菌為革蘭氏陰性菌，是一種胞內(nèi)寄生的球形或短桿狀菌，無鞭毛和莢膜，不形成芽孢。布魯氏菌是專性需氧菌，最適生長溫度為 37 ℃，最適pH 6.6~7.4 [4] 。布魯氏菌分為光滑型(Smooth，S)和粗糙型(Rough，R)菌落，也有 S-R 中間型菌落。 S 型細(xì)菌中細(xì)胞壁含有 O 鏈的 LPS，而 R 型 LPS 中 O 鏈缺失 [5] 。根據(jù)宿主特異性，布魯氏菌屬分為 6 個(gè)種，分別是流產(chǎn)布魯氏菌(牛種)、馬爾他布魯氏菌(羊種)、豬布魯氏菌、綿羊布魯氏菌、犬布魯氏菌和沙林鼠布魯氏菌。最近又發(fā)現(xiàn)了 6 個(gè)新的布魯氏菌種，分別是鯨型布魯氏菌(B. ceti)、鰭型布魯氏菌(B. pinnipedialis)[6] 、田鼠種布魯氏菌(B. microti)[7] 、岐見瑪瑙寶螺種布魯氏菌(B. inopinata，又名意外布魯氏菌，指意外在人類身上發(fā)現(xiàn))[8] 、狒狒種布魯氏菌(B. papionis)[9] 、赤狐種布魯氏菌(B. vulpis)[10] 。布魯氏菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分屬內(nèi)抗原和屬外抗原 [4] 。屬內(nèi)抗原包括 A、M 和 R 等表面抗原。S 型布魯氏菌的抗原決定簇主要位于 LPS 的多糖鏈部分，為 A 和 M 兩種表面抗原。LPS是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體的主要有效成分， O 鏈在血清學(xué)診斷中起重要作用 [5] 。R 型布魯氏菌共同具有 R 抗原。S 型布魯氏菌表面抗原與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌 O9、霍亂弧菌和大腸桿菌 O157 間有共同抗原成分 [4] 。

　　21 世紀(jì)以來，隨著畜牧業(yè)發(fā)展，布魯氏菌病在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出快速回升趨勢。布魯氏菌病疫情在全球分布廣泛，約有 1/5 的人口受到該病威脅，每年新發(fā)病例約 50 萬 [11] 。據(jù)有關(guān)數(shù)字統(tǒng)計(jì)，我國在 1996—2017 年，人的布魯氏菌病感染率從 0.09/100 000 上升到 2.79/100 000，是原來的 31 倍。人感染率的增加預(yù)示著動(dòng)物疫情的加重 [12] 。我國近年來的布病呈現(xiàn)老疫區(qū)死灰復(fù)燃，新疫區(qū)范圍持續(xù)擴(kuò)大，疫情小規(guī)模、多點(diǎn)散發(fā)的特點(diǎn) [11] 。我國《獸醫(yī)公報(bào)》的數(shù)據(jù)顯示，2011 年我國家畜布魯氏菌病發(fā)病 125 030 例，2012 年發(fā)病 28 958 次，2015 年 23 個(gè)省份發(fā)病 [13] 。因此，研制快速便捷的抗體檢測試紙條，加強(qiáng)動(dòng)物布魯氏菌病抗體水平監(jiān)測特別必要。

　　1　材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　布魯氏菌脂多糖(LPS)：本實(shí)驗(yàn)室提取;布魯氏菌，牛羊陽性血清、陰性血清，大腸桿菌 O157、小腸結(jié)腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結(jié)核病陽性血清：中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供。布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原：購自中國獸藥監(jiān)察所;硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、PVC 膠板：購自上海金標(biāo)生物;SPA、氯金酸：均為西格瑪產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑均為分析純。

　　1.2 方法

　　1.2.1 布魯氏菌 LPS 的提取及純化　采用熱酚法提取，具體方法見參考文獻(xiàn) [14]。

　　1.2.2 膠體金探針的制備　采用檸檬酸三鈉還原法，制備膠體金溶液。膠體金標(biāo)記的蛋白為金黃色葡萄球菌 A 蛋白(SPA)。具體方法見參考文獻(xiàn) [15]。

　　1.2.3 SPA 多克隆抗體的制備與純化　質(zhì)控線抗原采用 SPA 免疫的兔血清。將 SPA 免疫健康兔，免疫 3 次后，采血，析出血清。血清的純化采用辛酸 - 硫酸銨沉淀法。具體方法見參考文獻(xiàn) [14]。

　　1.2.4　試紙條的制備

　　1.2.4.1 質(zhì)控線(C 線)與檢測線(T 線)的劃線條件優(yōu)化　對 NC 膜上的 C 線和 T 線分別設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，進(jìn)行劃膜濃度摸索，確定劃膜濃度后，對包被條件從緩沖液、劃膜速度和劃膜寬度進(jìn)行優(yōu)化。

　　1.2.4.2 質(zhì)控線(C 線)與檢測線(T 線)的劃線方法　首先，將 2.5 cm 寬的 NC 膜貼在 PVC 膜的中間對應(yīng)位置。將純化好的 SPA 多克隆抗體按照摸索好的稀釋濃度稀釋后，裝入金標(biāo)劃膜儀的噴頭 1，將提取的 LPS，按照摸索好的稀釋濃度稀釋后，裝入金標(biāo)劃膜儀的噴頭 2;C 線與 T 線之間的距離設(shè)置為 4 mm，將貼在 PVC 板上的 NC 膜，固定在劃膜儀的合適位置，按開始鍵，進(jìn)行劃線。將包被好抗原的 PVC 板放于 37 ℃溫室中干燥 2 h 后，放密封袋中保存。

　　1.2.4.3 試紙條的組裝與斬切　在相對濕度控制在 30% 的溫室中，進(jìn)行試紙條組裝。取出包被有抗原的 PVC 板，取 3.3 cm 寬的吸水紙壓 NC 膜上端 2 mm，小心抹平，黏緊。0.6 cm 寬的金標(biāo)墊上端壓 NC 膜上端 1 mm，1.9 cm 寬的樣品墊上端壓金標(biāo)墊下方一半，每貼一種都要抹平黏緊。最后，在吸水紙上貼上綠色膠條，在金標(biāo)墊上貼藍(lán)色 MAX 膠條，包裝完成。用高速斬切機(jī)切成 3 mm 寬的試紙條，加入干燥劑，放入鋁箔袋密封保存。

　　1.2.4.4 試紙條的結(jié)果判定　將試紙條放入稀釋好的血清樣品中，樣品用量不可超過 MAX 線，室溫下作用 5~10 min，觀察結(jié)果。質(zhì)控線和檢測線均顯色，則為布魯氏菌抗體陽性;如果只有質(zhì)控線顯色，則為陰性;質(zhì)控線不顯色，該試紙條無效。

　　1.2.5 試紙條的鑒定

　　1.2.5.1　試紙條的敏感性檢測　布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品(4 000 IU/mL)用生理鹽水做倍比稀釋后用試紙條進(jìn)行檢測，出現(xiàn)陽性信號的血清最高稀釋度作為試紙條的敏感性。

　　1.2.5.2 試紙條的特異性檢測　同一批次試紙條分別檢測牛羊布魯氏菌病陽性血清和陰性血清各 2 份，大腸桿菌 O157、小腸結(jié)腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結(jié)核病陽性血清各 1 份，觀察其特異性。

　　1.2.5.3 試紙條的重復(fù)性檢測　取同一批次及不同批次制作的試紙條分別檢測同樣的布魯氏菌病陰陽性血清，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

　　1.2.5.4 試紙條的穩(wěn)定性檢測　取密封后置于室溫環(huán)境下保存 3、6、9、12、15 個(gè)月的試紙條進(jìn)行檢測，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)試紙條的穩(wěn)定性。

　　1.2.6 試紙條與虎紅平板試驗(yàn)比對　待檢血清樣品 60 份、陽性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清，陰性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清，分別采用該兩種方法，對 60 份樣品進(jìn)行檢測，根據(jù)結(jié)果評價(jià)二者符合率。

　　2　結(jié)果

　　2.1 膠體金表征分析

　　采用檸檬酸三鈉還原氯金酸方法制備的膠體金溶液，在其他反應(yīng)條件不變的情況下，濃度為 0.01% 氯金酸溶液中加入的檸檬酸鈉量與形成的膠體金顆粒大小呈反比，當(dāng)在 100 mL 體系內(nèi)快速加入 1.5 mL 1% 檸檬酸三鈉時(shí)，制備的膠體金顆粒大小約為 25 nm。制備的膠體金在自然光照下呈酒紅色，清澈透亮。制備的膠體金顆粒呈球形，分散性較好，顆粒大小均一。

　　2.2　試紙條的制備

　　2.2.1 C 線和 T 線條件優(yōu)化　對 NC 膜上的 C 線和 T 線分別設(shè)置幾個(gè)濃度梯度，進(jìn)行劃膜濃度的摸索，確定劃膜濃度后，對包被條件從緩沖液、劃膜速度和劃膜寬度進(jìn)行優(yōu)化。具體結(jié)果見表 1。

　　2.2.2　試紙條的組裝按照 1.2.4.3 的方法將試紙條組裝，使用時(shí)按照 1.2.4.4 方法判定。

　　2.3　試紙條的鑒定

　　2.3.1　敏感性檢測　布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性血清國家標(biāo)準(zhǔn)品(4 000 IU/mL)用新生牛血清進(jìn)行倍比稀釋后用試紙條進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示最低檢出量為 0.5 IU/mL(圖 2)。

　　2.3.2 特異性檢測　用膠體金試紙條檢測牛羊布魯氏菌病陽性血清和陰性血清各 2 份，大腸桿菌 O157、小腸結(jié)腸耶爾森菌、沙門氏菌、牛結(jié)核病陽性血清各 1 份。結(jié)果顯示，陽性血清均為陽性，陰性血清均為陰性，其他交叉菌均為陰性(圖 3)。

　　2.3.3 重復(fù)性檢測　用同一批試紙條檢測 10 份陰性血清和 10 份陽性血清，試驗(yàn)重復(fù) 3 次，結(jié)果一致。用 3 個(gè)不同批次試紙條分別檢測 10 份陰性血清和 10 份陽性血清，結(jié)果一致。

　　2.3.4　穩(wěn)定性檢測　于室溫環(huán)境下保存一批試紙條，分別于 3、6、9、12、15 個(gè)月，用同一批血清樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)保存 15 個(gè)月的試紙條顯色強(qiáng)度稍有減弱，仍能進(jìn)行結(jié)果判定。

　　2.3.5 試紙條與虎紅平板試驗(yàn)比對　待檢血清樣品共 60 份，陽性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清;陰性血清 30 份，包括 15 份牛血清和 15 份羊血清。分別采用上述兩種方法對 60 份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與虎紅平板凝集試驗(yàn)陽性符合率為 100%，陰性符合率為 96.67%，總符合率為 98.33%(表 2)。

　　3　討論

　　布魯氏菌能引起人、家畜和多種野生動(dòng)物患病，給畜牧業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失 [16] ，對人的健康造成重大的威脅，導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

　　通過對血清抗體的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，最早出現(xiàn)的抗體為 IgM，隨后是 IgG，再后是 IgA，持續(xù) 1 年左右開始下降;當(dāng)病情反復(fù)發(fā)作時(shí)，IgG 又可以迅速回升 [1] 。

　　我國動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646-2002)介紹了 4 種布魯氏菌病血清學(xué)檢測方法，分別是虎紅平板凝集試驗(yàn)、乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)。其中，前兩種方法適用于家畜布魯氏菌病田間篩選試驗(yàn)和乳牛場布魯氏菌病監(jiān)測及診斷的初篩試驗(yàn)，后兩種方法為我國動(dòng)物布魯氏菌病的確診方法 [17] 。2018 年國家動(dòng)物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃中也提議，布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)、OIE 推薦的間接 ELISA 和熒光偏振試驗(yàn)常被用于布魯氏菌病的初篩，試管凝集試驗(yàn)或補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或 OIE 推薦的競爭 ELISA 為布魯氏菌病的確診方法 [18] 。而在上述所提到的用于初篩的方法中，虎紅平板凝集試驗(yàn)由于操作簡單、成本低廉，被廣泛使用。但該方法結(jié)果判定主觀性強(qiáng)，主觀差異性較大。乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)只適用于奶牛，且操作方法復(fù)雜;熒光偏振方法需要特定的儀器設(shè)備，且價(jià)格昂貴，難以在基層中推廣使用。布魯氏菌病的臨床診斷更傾向于一種簡便、快速、不需要特殊儀器設(shè)備，適用于臨床高通量檢測的診斷方法。膠體金試紙條憑借其操作方便和判定迅速的優(yōu)勢，在動(dòng)物疫病檢測中已得到較廣泛的應(yīng)用 [19] 。目前國內(nèi)取得新獸藥證書的布魯氏菌抗體檢測試紙條有 2017 年中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所聯(lián)合 3 家生物制品公司申報(bào)的布魯氏菌抗體檢測試紙條，為一類新獸藥(農(nóng)業(yè)部公告號 2526)。該產(chǎn)品申報(bào)名稱雖然為試紙條，但是以檢測卡的形式，采用了競爭抑制免疫層析的原理，特異性較高，但靈敏度稍差，漏檢概率較大。

　　本研究采用的是布魯氏菌抗體檢測試紙條，利用了間接法免疫層析原理，對國家陽性血清標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出量能達(dá)到 0.5 IU/mL，和文中有可能存在交叉的血清均沒有交叉現(xiàn)象，靈敏度和特異性均較高，和虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率高達(dá) 98%，并且以試紙條形式，可以直接插入稀釋好的待檢樣品中，根據(jù)判定結(jié)果被時(shí)間直接讀取結(jié)果，簡單方便快捷。但是，不可否認(rèn)的是，相比虎紅平板凝集試驗(yàn)，價(jià)格成本相對較高;其次，由于在研制過程中，沒有加入濾血墊，因此不能進(jìn)行全血檢測。

　　4　結(jié)論

　　本研究進(jìn)行了試紙條的敏感性和特異性試驗(yàn)，并與虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行了比對試驗(yàn)，結(jié)果標(biāo)明該試紙條敏感性高、特異性好，且與虎紅平板凝集試驗(yàn)具有很高的符合率，可替代虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原用于布魯氏菌病初篩。下一步有待于擴(kuò)大樣本數(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步考核，同時(shí)還有待于臨床試驗(yàn)和實(shí)踐檢驗(yàn)。

　　《布魯氏菌抗體檢測試紙條的研制和初步比較》來源：《中國動(dòng)物檢疫》2018年10期，作者：齊安生;邵鈺;宮楓舉;張興進(jìn);張如民;朱紹輝;孫學(xué)強(qiáng)。