摘要: 外源性激素在中華鱉(Pelodiscus sinensis)性別決定有重要作用, 為給中華鱉性別決定機制研究提供生物學信息, 首次克隆和分析了中華鱉Foxl2 cDNA部分序列。為研究其在遺傳和生理水平的差異, 以10 mg/kg劑量17α-甲基睪酮(MT)和17β-雌二醇(E2 )分別對中華鱉雌雄個體注射, 檢測0、6h、12h、24h、48h、7d和14d性腺Foxl2 mRNA表達水平。獲得中華鱉Foxl2基因(GenBank登錄號: KP734210)部分 cDNA長903 bp, 共編碼 300個氨基酸, 屬于叉頭框轉錄因子家族, 參與卵巢發育和功能維持; 多重序列比對顯示, Foxl2具有典型的 FH結構域, 與紅耳龜的同源性最高, 達到99%; 系統進化樹分析顯示, 中華鱉Foxl2基因與爬行動物Foxl2基因聚為一個亞支, 且與西部錦龜Foxl2基因距離最近。熒光定量PCR結果顯示, 與對照組相比, 注射E2后24h, 卵巢Foxl2 mRNA表達水平被極顯著上調(P<0.001), 7d和14d后, 精巢Foxl2 mRNA表達水平極顯著上升 (P<0.001); 注射MT后24h, 精巢和卵巢Foxl2 mRNA的表達水平均極顯著升高(P<0.001)。結果表明, E2和MT促進Foxl2表達, E2促進其表達的性別差異比MT明顯。研究可為了解Foxl2的功能及明確外源性激素調控中華鱉 Foxl2的分子機制提供基礎資料。

　　關鍵詞: 中華鱉; Foxl2基因; 雌二醇; 甲基睪酮; mRNA表達

　　Foxl2(Forkhead transcriptionfactor gene 2)是叉頭狀轉錄因子超家族(Forkhead transcriptionfactor, FOX)成員之一[1, 2] , 1993年被發現, 主要在垂體和卵巢顆粒細胞中表達, 通過轉錄調節其目的靶基因的轉錄、蛋白表達, 參與顆粒細胞的增殖與分化, 與卵巢發育性二態分化和卵巢功能維持密切相關[2—4]。 Foxl2突變引起小瞼裂綜合征(BPES)、卵巢早衰 (POF)、腫瘤及山羊的無角間性綜合征(PIS)[4—6]。迄今Foxl2基因已在許多脊椎動物和部分無脊椎動物中獲得, 且結構高度保守。Foxl2在哺乳動物中研究最為深入, 被認為是雌性相關基因[4, 6]。國外學者對許多龜鱉動物的Foxl2基因進行了較為詳細的研究[7, 8] , 但對于中華鱉Foxl2基因的相關研究未見文獻報道。

　　中華鱉(Pelodiscus sinensis)隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科(Trionychidae)、鱉屬(Pelodiscus), 之前溫度依賴型性別決定模式已被公認, 但總有 20%—30%的個體并沒有沿溫度方向發育, 遺傳因素是影響其性別發育方向的重要方面[9]。對于爬行動物, 關鍵基因除外, 性激素在一定程度調控性別分化[10, 11] , 且在不同的發育階段發揮不同的作用 [12]。

　　本實驗室克隆了Foxl2 cDNA部分序列, 并以 10 mg/kg劑量的MT和E2對中華鱉成鱉進行注射實驗, 通過分析Foxl2表達變化, 旨在生理水平顯示外源性激素處理后Foxl2的響應模式, 以分析激素與性別相關基因的關系, 為中華鱉性別調控機制提供一定的生物學資料。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　2015年5月22日, 從重慶市北碚區歇馬鎮星云養殖場購買150只中華鱉, 體長為(12.01±2.01) cm, 體寬為(11.20±1.20) cm, 體重為(291.80±103.80) g, 置于室內淡水循環養殖池中暫養3d, 水源為曝氣自來水, 水溫為(26±0.5)℃。共分為5個組。

　　1.2 試劑

　　17α-甲基睪酮(MT)和17β-雌二醇(E2 )購自生工生物工程(上海)股份有限公司, Trizol試劑以及 pMD18-T Vector購自Takara, IScriptTM cDNA Synthesis Kit以及SsoFast Eva Green購自Bio-Rad, GoTaq(R)Green MasterMix和BM5000 DNA Marker購自Promega, 其余國產分析純試劑, 購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

　　1.3 實驗設計

　　在本實驗開展的前期, 已經研究了中華鱉Foxl2 多種組織的時空表達, 結果表現出典型的性別二態性, 卵巢表達量明顯高于精巢表達量(結果待發表), 在此研究工作的基礎上, 以同一濃度激素分別注射雌性與雄性個體, 充分顯示E2和MT對中華鱉成鱉 Foxl2基因表達的影響。

　　在馴養3d后, 剔除體弱或受傷個體, 測量體型參數, 注射激素后放入對應編號養殖池。1號池為對照組, 2、3、4、5號池為實驗組。劑量為10 mg/kg, 每組設3個重復, 每個重復10只, 實驗周期15d。注射后的0、6h、12h、24h、48h、7d和14d時間點隨機抽取實驗個體, 以0為對照組, 并取出卵巢和精巢組織置于液氮中保存備用, 后轉入–80℃冰箱保存, 以備總RNA提取。

　　1.4 總RNA提取與cDNA合成

　　上述采集到的組織樣品用研缽在液氮中充分研磨, 取100 mg左右的研磨干粉, 根據Trizol(TakaRa) 一步法提取各組織樣品總RNA, 所得到的總RNA定量到1 μg。通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳, Goldview染色, 檢測RNA的完整性。將所有樣品的總 RNA用微量核酸測定儀(NanoDrop 1000)測定其濃度和純度, 確保OD值在1.8—2.0。根據IScriptTM cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)試劑盒合成cDNA, 得到的cDNA –20℃保存備用。

　　1.5 基因克隆和序列分析

　　根據Ensembl網站預測的中華鱉Foxl2基因 mRNA序列, 針對于Foxl2基因的保守區域, 利用 Primer Premier 5.0軟件來設計兼并引物, 用于后續實驗過程中的同源克隆。設計好的引物序列由華大基因公司合成; 所涉及的引物如下: Foxl2 (F: 5′- ATGATGGCCAGCTACCAGG-3′, R: 5′-CTAGATG TCTATCCGGGAGTGC-3′); GAPDH (F: 5′-AGAA CATCATTCCAGCATCCA-3′, R: 5′-CTTCATCA CCTTCTTAATGTCGTC-3′, GenBank登錄號:AB 124567.1)。引物均稀釋為10 μmol/L備用。

　　2 結果

　　2.1 中華鱉Foxl2基因部分cDNA克隆

　　以卵巢組織cDNA為模板進行PCR, 產物電泳顯示一條約為903 bp的片段, 隨后經華大基因公司測序, 經NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行序列比對, 確定為中華鱉Foxl2基因片段, 編碼大約300個氨基酸殘基。將該序列提交GenBank, 已獲得登錄號: KP734210

　　2.2 E2對雌雄中華鱉Foxl2基因表達的影響

　　如圖 2所示, 處理6h后雌性個體中Foxl2的表達量高于對照組, 差異不顯著(P>0.05), 12h和24h后, E2極顯著上調雌性個體Foxl2的表達量(P<0.001), 其表達量呈現與時間相關的增加趨勢, 分別增加到對照組的8倍和18倍, 尤其在24h出現表達高峰, 至第48h和第7天時雌性個體Foxl2的表達量下降, 差異不顯著(P>0.05); 至14d后E2又顯著提升Foxl2的表達量(P<0.05), 達到對照組的5倍; 處理6h、24h和 48h后雄性個體Foxl2的表達量低于對照組, 差異不顯著(P>0.05), 至7d之前, E2對雄性個體Foxl2的表達影響均不顯著(P>0.05), 至7d和14d后, E2極顯著上調Foxl2的表達量(P<0.001), 均增加到對照組的 5倍。結果顯示: 1 mg/mL E2明顯促進雌性中華鱉 Foxl2的表達, 促進高峰在24h, 隨著時間的推移其促進作用呈現減弱的趨勢; 1 mg/mL E2在注射后期促進雄性中華鱉Foxl2的表達, 其促進高峰時間比雌性個體大大延遲, 表達高峰出現在7d和14d, 且其表達量整體要低于在雌性個體中的表達量。 2.3 MT對雌雄中華鱉Foxl2基因表達的影響如圖 3所示, 處理6 h和12h后雌性個體中 Foxl2的表達量高于對照組, 差異不顯著(P>0.05); 至24h之前, MT對雌性個體Foxl2的表達影響不顯著(P>0.05), 隨著時間的延長; 至24h后, MT極顯著上調雌性個體中Foxl2的表達(P<0.001), 出現表達高峰, 達到對照組的17倍; 至第48h、第7和第14天后, Foxl2的表達量呈現顯著下降的趨勢(P<0.05), 但均穩定在高于注射前5倍的水平。處理6h和 12h后雄性個體Foxl2的表達量與對照組持平, 差異不顯著(P>0.05); 隨著注射時間的延長, 尤其在24h, MT極顯著促進Foxl2的表達(P<0.001), 出現表達高峰, 達到對照組的5倍; 第48h后, 其表達量低于對照組(P>0.05); 7d后, Foxl2的表達量又出現顯著回升的趨勢(P<0.05); 至14d后, 其表達量略微下降。

　　結果顯示: 1 mg/mL MT明顯促進雌性中華鱉 Foxl2的表達; 除48h外, 1 mg/mL MT對雄性中華鱉 Foxl2的表達呈現不同程度的促進作用, 但其作用沒有雌性明顯, 且無論雌雄, 24h時MT的促進作用最強。

　　3 討論

　　3.1 中華鱉Foxl2基因序列分析

　　多重序列比對顯示中華鱉Foxl2基因部分片段含有一個高度保守的FH結構域, 且與其他很多物種具有很高的相似性, 說明該結構域在不同物種生長發育過程中發揮重要作用; 同源性分析表明, 中華鱉Foxl2基因是已發現物種Foxl2基因的同源基因, 該基因在進化上具有較高的序列保守性和功能一致性; 其中與紅耳龜和西部錦龜的同源性分別達到99%和92%, 說明其在進化上與爬行類的同源性; 聚類分析表明中華鱉與西部錦龜的Foxl2基因在同一大支, 而與氨基酸同源性較高的紅耳龜的 Foxl2基因親緣關系較遠, 這說明Foxl2基因在進化過程中承受了不同的選擇壓力, 最終導致不同物種之間該基因的進化速率差異, 但是其在進化過程中變異還是較小, 且保守性很高, 其演化關系也與生物學結果一致。

　　3.2 E2對中華鱉Foxl2基因表達的影響

　　在非哺乳脊椎動物中, 雌激素是卵巢分化的關鍵因素, 但其作用機制仍不甚了解。本研究結果顯示, E2促進中華鱉Foxl2基因的表達, 雌性的促進作用比雄性明顯, 且其表達高峰時間比雄性提前(提前一周), 可以判斷E2以不同的途徑調控中華鱉雌雄個體中Foxl2基因表達。目前國內外對中華鱉 Foxl2基因的研究尚少見報道。多數文獻報道雌激素促進Foxl2的表達[13, 14] ; 降低雌激素合成或者抑制雌激素信號轉導均可顯著抑制Foxl2的表達[15, 16] , 如南方鲇(Southern catfish)[17]、虹鱒(Rainbowtrout)[18]、雞(Gallus gallus) [19]以及稀有鯽(Gobiocypris rarus) [20] ; 關于其調控機制, 有學者解釋為 Foxl2基因通過激活芳香化酶(雄激素轉化為雌激素的關鍵酶)的表達, 從而共同調控雌激素的生成[21, 22] ; 哺乳動物中也有類似現象[23] ; 本研究中雌性的表達結果與以上研究結果一致。雌激素信號傳導過程依賴于細胞環境和受體的存在, 即雌激素受體 (ERα和ERβ)以及跨膜受體GPER(非基因組通路), 基因組通路(ERα和ER)的表達水平可以發生轉換, 這種轉換允許E2在不同的方向介導其作用并調節未成熟支持細胞的增殖[24]。正常雌性個體中雌激素受體及其相應原件均處于非激活狀態。從本研究結果來看E2可能通過激活雌性個體中的ERα或者ERβ來啟動相應原件(在基因轉錄水平上)上調 Foxl2的表達, 當細胞內激素濃度發生改變, 則開始調動GPER來調節激素平衡。但是我們并沒有檢測內源激素水平和性腺發育狀態, 所以不能進行驗證, 而且雌激素的具體作用機制比較復雜, 這也是我們后續的研究熱點。最

　　新研究報道, 雌激素在動物雄性個體中同樣發揮重要作用, 其中雌激素介導的ERα信號對于生殖細胞活性和維持生精上皮的正常組織至關重要。雌激素的生理水平對精子生成至關重要, 高劑量對精子發生有損傷作用, 而低劑量則對其有積極作用[24]。Hultman等 [25]也發現EE2處理雄性虹鱒后, Foxl2表達水平上升。中華鱉雄性個體中Foxl2的表達水平在E2暴露7d后明顯上升, 這說明E2在雄性中華鱉生長后期發揮了重要作用, 但是對于具體機制, 尚不清晰, 還需進一步研究。

　　3.3 MT對中華鱉Foxl2基因表達的影響

　　中華鱉雌雄個體注射MT后, Foxl2基因表達增強, 在24h時均出現表達高峰, 之后逐漸減弱, 其變化趨勢可能與體內外源MT有效劑量的變化相關, 表明中華鱉雌雄個體以相同的節奏和強度應答外源MT, 24h是Foxl2基因應激MT的敏感時期, 且 MT對雌性個體的作用比雄性強烈。

　　有文獻報道MT在魚類等性逆轉過程中發揮重要作用[26, 27] ; Fenseke和Segner[28]用10000 ng/L劑量的MT處理斑馬魚, 結果發現CYP19b表達量上升。雄激素的信號傳導過程主要依賴以下3個途徑: 直接與雄激素受體(AR)結合、或者在芳香化酶的作用下轉化為雌二醇, 隨后雌二醇與雌激素受體結合而發揮效應, 也可以轉化為二氫睪酮(DHT)。本研究結果表明Foxl2基因的表達依賴以上機制的相互作用。MT影響雌雄個體的高峰期一致, 也說明 MT促進中華鱉Foxl2基因表達的性別差異較小, 但是以上機制之間的具體作用機理及如何切換我們目前還不清楚。而且MT是直接作用于Foxl2基因還是通過間接的激素平衡反饋機制, 我們也不得而知。我們推測MT暴露不久后, MT轉化為了內源性的E2 , 雌雄性個體的應答機制間接轉為擬雌激素效應, 并通過干擾內源性激素的合成及代謝而發揮作用。此外還有研究表明MT抑制Foxl2基因的表達 [29] , 這可能由于多種因素導致, 例如所使用的性激素化合物種類不用; 所采用方法的不同; 注射時間和濃度的差異; 或者是實驗動物所處的不用發育或生理時期等因素造成的。相關研究表明, 使用外源雄激素和芳香化酶抑制劑后, 血清中E2水平下調 [30—32] , 但是我們沒有檢測中華鱉血清內激素含量的變化, 所以無法進行驗證, 這也是本文的不足之處。總之, 基因在信號通道和代謝2個水平產生重 .

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