摘要：通過提高DAAO的酶活來進一步提高本研究的多酶轉化體系的轉化效率。本章通過對來源于Rhodosporidiumtoruloides的DAAO（RtDAAO）的N-端進行研究，并通過一系列的改造和修飾，提高了RtDAAO在E.coli中的可溶性表達，同時又保證了宿主細胞的生長，以便于表達后重組菌的收集和多酶級聯體系的制備。

　　關鍵詞：N-端；DAAO；酶活

　　1.多酶級聯體系轉化過程速率分析

　　為了準確建立數學模型，對轉化過程中涉及的反應速率及相應的底物及產物必須進行詳細的分析。如圖1所示，本文研究的級聯轉化體系涉及四個酶，五個反應速率過程。根據反應體系設計，整個反應過程主要分為兩步，第一步所用的酶為D-氨基酸氧化酶（DAAO）和過氧化氫酶（CAT），混旋底物中的D-正纈氨酸經DAAO氧化生成前手性物2-氧代戊酸。DAAO的反應過程除了底物涉及到輔酶FAD用于氫負離子的傳遞，同時需要氧氣重新氧化FADH2，使得DAAO具有活性，重新加入反應過程中。其中FAD與酶緊密結合，不需要外源添加，因此氧氣的供應對DAAO的活性具有重要的意義，是本反應需要考慮的重要因素之一。而氧氣的供應受到從氣體到液相的傳質的限制，所以DAAO的酶活提高與底物氧化的速率提高的幅度才出現了不對等的情況。CAT的作用是用于消除反應副產物H2O2，同時也能夠回收一部分氧氣直接參與DAAO的反應。所以，如圖第一步涉及的反應速率記為r1和r2。第二步所用的酶是亮氨酸脫氫酶（LDH）和甲酸脫氫酶（FDH），這一步涉及三個反應速率記為r3，r4和r5。LDH在催化酮酸的不對稱還原胺化反應屬于可逆反應，雖然反應平衡傾向于合成氨基酸方向，為了準確描述轉化過程，其逆反應也是需要考慮在內，所以需考慮r3和r4。FDH用于合成輔酶NADH，與亮氨酸脫氫酶形成輔酶循環，使得反應得以進行，因此對于轉化過程的描述也需要考慮其反應速率r5。從整體的轉化來看，本文研究的轉化體系涉及到很多副產物小分子的體系內回收利用，如氧氣、NH3及輔酶NADH等。

　　2.動力學參數

　　在建立動力學模型的基礎上，為了使該模型能夠得到應用，需要進一步測定模型中的所有動力學參數。同時，參數測定的準確性也會影響到模型描述轉化過程的準確性及其預測結果。因此，所有參數的測定條件是在L-正纈氨酸的最佳轉化條件下進行的。利用初始速率法測定動力學參數，涉及反應的化合物對初始速率的影響均被測量。DAAO的動力學測定數據及方程擬合，可以看出產物2-氧代戊酸對DAAO的抑制。同時，DAAO不受底物D-正纈氨酸的對應異構體的抑制。該反應可以回收部分氧氣。LDH催化的可逆反應是本體系轉化的第二步反應，可以看出，正向反應不僅受到產物的競爭性抑制，同時高濃度底物對其也有抑制作用，因此轉化體系最好不要有過多的中間產物2-氧代戊酸的積累。由于反應平衡偏向于正向反應，所以產物L-正纈氨酸的氧化脫氨基本可以忽略不計。最后是輔酶NAD再生循環的反應速率，其大小影響到了LDH的正向反應，因此，在轉化體系中具有重要的作用。

　　3.模型的準確性驗證

　　模擬結果中D-正纈氨酸的消耗曲線基本能夠很好的與實驗數據相擬合。同時模擬結果也顯示了轉化過程中間產物2-氧代戊酸的積累，由于實驗測量無法實時監控，所以并不知道中間產物在哪個時間點達到最大積累量。然而模型模擬可以顯示在D-正纈氨酸剛被消耗完也就是轉化時間不到2h的時候，中間產物的積累達到最高峰。該結果可以看出由于DAAO快速氧化D-正纈氨酸導致2-氧代戊酸大量合成，而轉化體系第二步由于NADH供應不足來不及胺化還原第一步產生的2-氧代戊酸，使得中間產物逐漸積累并在底物消耗完的時間左右達到了最高峰。因此，想要進一步提高體系的轉化效率，關鍵是提高轉化體系第二步的效率，也就是提高FDH的酶活，加強NADH的供應。通過N-端修飾提高了DAAO的酶活而的轉化速率卻沒有獲得相應比例的提高，是由于轉化過程中存在制約因素即氧氣的供應。因此，在提高FDH酶活前，需要通過模型進行預測，根據預測結果來提高FDH的酶活，避免過多的提高導致無用的活性。

　　4.模型預測

　　綜合上述對體系不同酶量組別轉化組別的分析可知，目前體系中甲酸脫氫酶酶活無法達到最佳轉化的條件，同時也計算得出在有充足的DAAO和LDH條件下，FDH在體系中酶活至少要達到4.67×102U/L，同時，進一步提高FDH的酶活，則DAAO和LDH的活性可以適當的降低但是要保證位于預測的范圍。所以，最佳體系還需根據改造后FDH的最終酶活進行調整。

　　5.結論

　　據測得的參數數值使用模型，模擬得到的結果與在相同條件下的L-正纈氨酸的轉化過程的實驗數據基本吻合，證明本研究所構建的數學模型能夠準確地描述L-正纈氨酸的轉化過程，可以用來預測L-正纈氨酸轉化從而指導多酶級聯體系中酶表達比例的優化。

　　利用已驗證的數學模型模擬預測不同DAAO和FDH酶量體系的轉化速率及過程中間產物積累量得到最佳轉化體系要求DAAO和FDH的范圍和兩者的最少酶活。同時，也預測了不同LDH和FDH酶量體系的轉化速率及轉化結束中間產物含量來進一步得到高轉化率和轉化效率的體系。綜合兩組預測，FDH的最低酶活為4.67×102U/L，同時模擬得到的酶活范圍表明，最佳體系中DAAO和LDH的酶活可以隨FDH的酶活提高而適當降低。

　　參考文獻

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