【摘 要】 【目的】 探討白細胞介素17(IL-17)、干擾素γ(IFN-γ)在不同類型慢性中耳炎(COM)中的表達水平及與骨質破壞的關系。【方法】 用免疫組織化學的方法檢測了實驗組37例慢性中耳炎病變組織(膽脂瘤中耳炎20例，非膽脂瘤中耳炎17例)和對照組18例(13例正常外耳道皮膚及5例正常中耳黏膜)中的IL-17、IFN-γ的表達。【結果】 IL-17在膽脂瘤中耳炎、非膽脂瘤中耳炎、外耳道皮膚及中耳黏膜中的陽性表達指數分別為(81.6 ± 20.0)%、(43.3 ± 25.7)%、(4.7 ± 1.9)%和(5.6 ± 2.3)%，實驗組與對照組比較差異有統計學意義(P < 0.001);IFN-γ在膽脂瘤中耳炎、非膽脂瘤中耳炎、外耳道皮膚及中耳黏膜的陽性表達指數分別為(65.4 ± 24.0)%、(30.1 ± 24.5)%、(4.8 ± 1.8)%和(4.0 ± 1.6)%，實驗組與對照組差異有統計學意義(P < 0.001);慢性中耳炎病變組織中IL-17(r = 0.685，P < 0.001)、IFN-γ(r = 0.662，P < 0.001)與骨質破壞程度均成正相關。【結論】 慢性中耳炎患者病變組織中的IL-17、IFN-γ表達水平的上調可能與該病骨質破壞的發生有關。

　　【關鍵詞】 IL-17; IFN-γ; 慢性中耳炎; 骨質破壞; 破骨細胞　醫學職稱論文

　　慢性中耳炎(chronic otitis media， COM)是常見的中耳炎性疾病，目前主要將其分為膽脂瘤型中耳炎及非膽脂瘤型中耳炎兩型。骨質破壞是它們的基本病理特征之一，流行病學調查顯示膽脂瘤型中耳炎骨質破壞的發生率為80%，而在非膽脂瘤型中耳炎中也達到了10% ～ 20%的發病率[1]。然而目前關于骨質破壞發生的確切機制仍不清楚，近幾年的研究發現慢性中耳炎患者的局部病灶中有大量的炎性細胞侵潤，這些炎性細胞及其分泌的細胞因子參與調節了破骨細胞的活化，而后者被認為可能是中耳炎性疾病骨質破壞的最終效應細胞。因此，有學者推斷慢性中耳炎的骨質破壞與局部病灶中的各種炎癥細胞及因子有密切關系[2-4]。白細胞介素17(interleukin17，IL-17)、干擾素γ(interferonγ，IFN-γ)分別是Th17、Th1的標志性細胞因子，它們在機體免疫應答中起到關鍵作用，具有多種免疫活性，不僅可以作為強大的前炎癥因子激活局部的炎癥反應，還可以調節破骨細胞的生成而影響骨質吸收。但目前有關于IL-17、IFN-γ與慢性中耳炎的研究相對較少，因此，本研究通過觀察IL-17、IFN-γ在不同類型慢性中耳炎中的表達特點，試圖探討它們與骨質破壞的相關性。

　　1 材料與方法

　　1.1 病例資料

　　實驗組37例，為2008年7月-2009年5月在中山大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科醫院行改良乳突根治術并鼓室成形術并符合納入標準的慢性中耳炎患者，年齡18 ～ 66歲，病程10個月 ～ 40年，男24例，女13例;分為膽脂瘤組20例和非膽脂瘤組17例，其中膽脂瘤組的研究標本為膽脂瘤型中耳炎的膽脂瘤和上皮下基質組織，非膽脂瘤組為骨瘍型中耳炎的肉芽組織，對照組為13例外耳道上皮標本(從上述37例患者隨機獲取)及5例正常中耳黏膜組織(從顳骨外傷骨質患者行面神經減壓術中獲取);全部標本均經過術后常規病理活檢得到證實。所有受檢者實驗前2周內均未全身或局部使用糖皮質激素及免疫抑制劑。

　　1.2 實驗方法

　　兔抗人IL-17、IFN-γ多克隆IgG抗體均購自SANTA CRUZ公司，Envision法免疫組織化學試劑盒和DAB顯色盒購自北京中杉生物公司。　　將石蠟包埋的標本4 μm厚連續切片，常規脫蠟水化后，用30 mL/L過氧化氫甲醇溶液阻斷內源性過氧化物酶活性;0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)95 ℃加熱，抗原修復;滴加一抗(IL-17、IFN-γ多克隆兔IgG抗體)，工作濃度為1 ∶ 100;4 ℃過夜;滴加第二抗體，37 ℃孵育30 min; DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，用PBS代替一抗做陰性對照。

　　陽性結果判定：陽性染色呈棕黃色，觀察其在各組標本中表達的分布特點及其在細胞內的表達部位。高倍鏡(400倍)下每張切片隨機選取5個視野， 計數每個視野內細胞總數(N)及陽性染色細胞數(n)，并計算出每例單位視野內細胞總數(∑N)及陽性細胞總數(∑n)，求出每例標本的陽性指數(PI)，應用公式PI = ∑n/∑N × 100%，取各視野陽性細胞表達的平均數作為陽性細胞表達率[5]。采用雙盲法觀察，由中山大學附屬第一醫院病理科兩位技術員分別進行。

　　1.3 骨質破壞程度分級

　　以手術術中高倍顯微鏡下所見及影象學資料對37例患者進行判斷分為3級：輕度，盾板和單個聽小骨破壞;中度，兩個或兩個以上聽小骨和鼓室蓋、乳突蓋的破壞;重度，聽小骨的完全性破壞和骨迷路、外耳道后壁以及面神經骨管的破壞[6]。所有資料與2008年7月-2009年5月在中山大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科醫院獲取。

　　1.4 統計學處理

　　數據以均數 ± 標準差表示，采用Mann-Whitney test、Kruskal-Wallis test和Spearman correlation test進行數據分析，檢驗水準取α = 0.05。

　　2 結 果

　　2.1 IL-17的表達情況

　　IL-17陽性表達定位于細胞質內，呈棕黃色，部分細胞核著色，20例膽脂瘤組織標本和17例非膽脂瘤肉芽組織中均有表達，呈不同程度的高、中、弱表達。膽脂瘤組織標本中IL-17陽性表達細胞分布于膽脂瘤上皮下基質中，多為浸潤的炎性細胞，細胞質豐富，在肉芽組織中IL-17陽性表達細胞為侵潤的炎性細胞，兩者IL-17的陽性指數(PI)均值分別為(81.6 ± 20.0)%和(43.3 ± 25.7)%，與非膽脂瘤組肉芽組織相比，IL-17在膽脂瘤組織中的表達明顯增加(P = 0.001)。13例外耳道皮膚標本中幾乎沒有IL-17陽性表達，僅在皮下組織中有散在幾個含有棕黃色顆粒的細胞，PI為(4.7 ± 1.9)%。IL-17在膽脂瘤組織中的表達明顯高于對照組(P < 0.001); IL-17在非膽脂瘤組肉芽組織中的表達亦高于對照組(P < 0.001); 3組比較差異有統計學意義(P < 0.001);IL-17在中耳黏膜的PI為(5.6 ± 2.3)%，與膽脂瘤組織(P < 0.001)及非膽脂瘤組織(P < 0.001)相比，表達明顯減少;與外耳道皮膚組織相比，表達量無明顯差異(P > 0.05;圖1及圖2)。

　　2.2 IFN-γ的表達情況

　　IFN-γ陽性表達定位于細胞質內，呈棕黃色，部分細胞核著色， 20例膽脂瘤組織標本和17例非膽脂瘤組肉芽組織中均有表達，呈不同程度的高、中、弱表達。膽脂瘤組織標本中IFN-γ陽性表達細胞分布于膽脂瘤上皮下基質中，多為浸潤的炎性細胞，細胞質豐富，在肉芽組織中IFN-γ陽性表達細胞為侵潤的炎性細胞，兩者IFN-γ的陽性指數(PI)均值分別為(65.4 ± 24.0)%和(30.1 ± 24.5)%，與非膽脂瘤組肉芽組織相比，IFN-γ在膽脂瘤組織中的表達明顯增加(P = 0.002)。13例外耳道皮膚標本中幾乎沒有IFN-γ陽性表達，僅在皮下組織中有散在幾個含有棕黃色顆粒的細胞，PI為(4.8 ± 1.8)%。IFN-γ在膽脂瘤組織中的表達明顯高于對照組(P < 0.001); IFN-γ在非膽脂瘤組肉芽組織中的表達亦高于對照組(P < 0.001); 三組比較差異有統計學意義(P < 0.001);IL-17在中耳黏膜的PI為(4.0 ± 1.6)%，與膽脂瘤組織(P < 0.001)及非膽脂瘤組織(P < 0.001)相比，表達明顯減少;與外耳道皮膚組織相比，表達量無明顯差異(P > 0.05;圖1及圖2)。

　　2.3 IL-17、IFN-γ與骨質破壞程度的相關性

　　對不同類型慢性中耳炎病灶中的IL-17、IFN-γ相對表達量與骨質破壞程度間的關系進行分析，詳見表1、表2。結果顯示在每一實驗組，骨質破壞程度不同級別下的IL-17、IFN-γ的陽性指數之間差異有統計學意義(P < 0.05;圖3)，兩兩比較發現不同級別之間差異均有統計學意義(P < 0.05);進一步行Spearman等級相關分析，結果顯示IL-17(r = 0.685，P < 0.001)、IFN-γ(r = 0.662，P < 0.001)與骨質破壞程度密切相關，隨著IL-17、IFN-γ相對表達量的增加，骨質破壞程度也隨著加重。

　　3 討 論

　　Hofbauer等[7]提出關于細胞因子對破骨細胞調控的收斂假說，認為大多數上游細胞因子和激素最終都是通過對OPG/RANK/RANK的調控而影響活性破骨細胞池的大小。一旦一個或多個上游因子的變化，將導致RANKL與OPG平衡破壞，從而引起骨質代謝的紊亂[8]。在慢性中耳炎骨質破壞機制的研究中，也發現諸多細胞因子參與其中，如Akimoto等[9]發現在膽脂瘤中TNF-α表達明顯增高，且廣泛性骨質破壞的膽脂瘤中TNF-α含量明顯高于局限性骨質破壞的膽脂瘤;Marenda等[10-11]研究顯示IL-6在中耳膽脂瘤表達上調，且表達量與聽小骨鏈的破壞的關系極為顯著，但關于這些細胞因子是通過何種途徑調控OPG/RANK/RANK系統尚不明確。

　　3.1 IL-17與慢性中耳炎骨質破壞的關系

　　隨著骨免疫學的發展，人們發現，T淋巴細胞及其分泌的細胞因子對于破骨細胞的調控及骨質破壞的啟動有重要作用。Kotake等[12]證實IL-17可以通過調節破骨細胞前體及成骨細胞間的相互作用來激活破骨細胞的成熟，IL-17首先作用于成骨細胞，通過刺激COX-2促進PEG2的合成，進而誘導RANKL基因的表達，打破RANKL與OPG之間的平衡，啟動骨質破壞。另一方面，IL-17是Th17參與免疫應答的主要效應因子，在疾病發展的各個階段，IL-17發揮其強大的前炎癥因子作用，誘導多種細胞因子的表達。如Kuligowska等[13]發現IL-17以時間和劑量依賴方式誘導IL-1和TNF-α分泌;還有學者等[14]報道IL-17可以誘導基質金屬蛋白酶9的表達，而這些下游因子在骨質破壞發生的不同階段發揮作用。以上研究結果表明IL-17是誘導骨質破壞的關鍵因子。目前關于IL-17與慢性中耳炎的研究尚屬空白，顧之燕等[15]指出慢性中耳炎是由T淋巴細胞介導的慢性炎癥反應，T細胞及其細胞因子在慢性中耳炎的發病過程中起到了重要作用。結合本研究結果：IL-17在慢性中耳炎中的膽脂瘤組織和肉芽組織中均有不同程度的表達，與正常外耳道皮膚比較，表達顯著上調; 而且IL-17(r = 0.685， P < 0.001)的陽性表達細胞數和骨質破壞的程度成正相關。我們推斷IL-17可能是引起慢性中耳炎骨質破壞的關鍵因子，它作為上游調控因子，一方面直接影響RANKL與OPG之間的平衡，另一方面促進其他細胞因子的表達，間接影響骨質破壞的發生。

　　3.2 IFN-γ與慢性中耳炎骨質破壞的關系

　　IFN-γ作為Th1的標志性細胞因子，對于破骨細胞的調控一直存在爭議。Takayanagi等[16]報道在體外實驗中，IFN-γ可以通過快速降解RANK的銜接蛋白-TRAF6來干擾RANKL的信號在細胞內的傳導，并且拮抗IL-17的作用來抑制破骨細胞的形成。而Gao等[17]在活體研究中發現IFN-γ是破骨細胞形成的潛在刺激劑，它可以上調MHC-Ⅱ抗原的表達，進而促進T細胞的活化與增殖。而活化的T細胞可以產生大量的RANKL和TNF-α等。他們認為在活體內， IFN-γ這種間接的促進作用已經遠遠超過其對破骨細胞前體的抑制作用，最終導致破骨細胞的形成，出現骨質破壞。本研究結果發現IFN-γ在慢性中耳炎中的膽脂瘤組織和肉芽組織中均有表達，與正常外耳道皮膚比較，差異有統計學意義，且IFN-γ的陽性表達細胞數和骨質破壞的程度成正相關(r = 0.662，P < 0.001)。沈志忠等[18]用流式細胞分析技術對膽脂瘤中耳炎患者外周血中IFN-γ的表達進行檢測，結果與本研究相似，表明IFN-γ在慢性中耳炎骨質破壞中起到了促進作用。

　　3.3 本研究的局限性

　　目前已證實破骨細胞是慢性中耳炎骨質破壞的最終作用細胞，諸多細胞因子參與了破骨細胞的活化，它們相互促進，相互拮抗，形成一個復雜的網絡通路。本研究結果表明慢性中耳炎病變局部的IL-17、IFN-γ可能作為關鍵的上游調控因子參與骨質破壞的發生，為進一步完善該網絡通路做了一些基礎工作。但Chole等[19]通過研究發現在臨床膽脂瘤標本中有活性的破骨細胞罕見，而在實驗性膽脂瘤中卻可見大量活性破骨細胞和破骨細胞前體細胞的存在。本文亦未從破骨細胞的數量及活化程度與兩種因子進行相關性分析，其主要原因主要有以下幾點[20]：①常規的實驗方式包括電鏡和光鏡的取材、觀察范圍有限，無法檢測出破骨細胞。本課題組通過前期實驗發現，對75例膽脂瘤標本、63例慢性中耳炎肉芽組織及破壞的聽小骨進行HE染色后，光鏡下觀察，僅發現2例膽脂瘤標本中有破骨細胞。②破骨細胞作為一種瞬時細胞其生命周期相對較短，所以雖然觀察到骨質破壞，但在進行組織取材固定過程中，可能破骨細胞已經出現凋亡。③中耳膽脂瘤疾病過程包括急性及平穩期，在疾病急性期所固定的標本，則可能檢測到破骨細胞，反之則檢測不到。④標本來源于需要手術的病人，這些病人多數已經過藥物的保守治療，這些藥物會抑制破骨細胞。所以要直接檢測破骨細胞的數量及活性，在技術方面和病例選擇方面有一定難度。本實驗雖未直接表明IL-17、IFN-γ與破骨細胞的關系，但是通過分析兩種因子和骨質破壞程度呈正比，再結合IL-17、IFN-γ的生物學活性，能間接地從一定程度上說明兩種因子在中耳膽脂瘤中可能是通過調控破骨細胞的活性來參與骨質破壞的形成。進一步研究應對一些相關影響因素進行嚴格限制(如加大標本量，嚴格區分患者有無治療，采用敏感性高的檢測方法等)。

　　3.4 小 結

　　總之，實驗結果表明IL-17、IFN-γ參與了中耳膽脂瘤疾病的發生發展，在骨質破壞的形成過程中起到了重要的作用。因此我們可以推測在中耳膽脂瘤的保守治療中以IL-17、IFN-γ為靶點，阻斷兩者的作用，對減緩疾病的發展和并發癥的發生、減小手術風險和難度、改善預后并提高患者的生活質量有一定的臨床意義。但目前有關IL-17、IFN-γ與慢性中耳炎的研究相對較少，本研究也僅僅從蛋白質水平對IL-17、IFN-γ在慢性中耳炎中的表達進行了粗淺的探討，要確切了解IL-17、IFN-γ在慢性中耳炎骨質破壞中的具體作用及兩者間相互調控的機理，尚有待于更深入的研究。

　　【參考文獻】

　　Lin YS， Lin LC， Lee FP. The prevalence of chronic otitis media and its complication rates in teenagers and adult patients [J]. Otolaryngol Head Neck Surg， 2009， 140(2)： 165-170.