摘要：近年來(lái)各類(lèi)型食品安全事件頻發(fā)，社會(huì)上下對(duì)于食品安全問(wèn)題也愈發(fā)重視。根據(jù)各類(lèi)型食品安全事件來(lái)看，食源性致病菌是引起食品安全問(wèn)題的主要因素。目前在我國(guó)檢測(cè)食源性致病菌的主要手段為細(xì)菌分析、培養(yǎng)、生化鑒定等工作，該方法操作周期較長(zhǎng)，并且檢測(cè)手段十分繁瑣，在檢測(cè)過(guò)程中往往只能檢測(cè)一種病菌，并且得出檢測(cè)報(bào)告的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4~7d，基于此新型食源性致病菌檢測(cè)手段的研究至關(guān)重要。等溫?cái)U(kuò)增法在此情況下誕生，該方法因?yàn)閷?duì)儀器要求不苛刻，核酸擴(kuò)增高效、特異性好等優(yōu)點(diǎn)迅速成為食品安全行業(yè)食源性致病菌的檢測(cè)手段。文章從環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法技術(shù)原理到其與新技術(shù)（包括橫向試紙法（Lateralflowdipstick,LFD），表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhancedRamanscattering,SERS），微流控芯片技術(shù)（micro-fluidics,MF））結(jié)合方法在微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行論述，并對(duì)其在微生物快檢方面的前景進(jìn)行展望。

　　關(guān)鍵詞：等溫?cái)U(kuò)增法；致病菌；微生物快檢

　　根據(jù)世界衛(wèi)生組織的相關(guān)調(diào)查可知，有關(guān)食品中的有害病源微生物等高達(dá)200余種，每年在全球范圍內(nèi)大約200多×104人的死亡都與食品安全有關(guān)，其中食源性致病菌是導(dǎo)致各種食品安全問(wèn)題的主要原因。在我國(guó)，雖然沒(méi)有專(zhuān)門(mén)針對(duì)食源性致病菌的診斷與報(bào)告，但是根據(jù)食品安全事故的發(fā)生情況來(lái)看，每年大約有4800×104人都會(huì)因?yàn)槭称穯?wèn)題前往醫(yī)院進(jìn)行診治，其中超過(guò)12×104的患者會(huì)因?yàn)槭称钒踩朐褐委煟?000余人會(huì)直接死于食源性疾病，由此可見(jiàn),食源性致病菌的危害不可小覷,對(duì)于食源性致病菌的快速檢測(cè)技術(shù)普及尤其迫切，等溫?cái)U(kuò)增法因?yàn)閷?duì)儀器要求較低，已廣泛應(yīng)用于DNA擴(kuò)增的檢測(cè)和診斷。例如，許多病原體，如病毒、真菌、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)都可以使用LAMP進(jìn)行檢測(cè)，其他生物源，如轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物都可以作為L(zhǎng)AMP的檢測(cè)對(duì)象。其具備核酸擴(kuò)增高效、特異性好等優(yōu)點(diǎn)有望成為食品安全行業(yè)食源性致病菌的重要檢測(cè)手段。

　　1技術(shù)原理

　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedistemperatureamplification,LAMP)是一種簡(jiǎn)單、快速的方法，不需要昂貴的設(shè)備即可擴(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)序列，只需要一個(gè)溫度控制的加熱塊或水浴進(jìn)行等溫放大反應(yīng)，需要采用一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)部引物，對(duì)目標(biāo)基因的6個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行識(shí)別，然后利用BstDNA聚合酶在恒溫條件下參與反應(yīng)以完成目的基因的擴(kuò)增。在目標(biāo)序列當(dāng)中，2個(gè)引物能夠組成一個(gè)互補(bǔ)序列，并且組成的互補(bǔ)序列會(huì)形成可啞鈴狀結(jié)構(gòu)，使得擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)，在此過(guò)程中，通過(guò)添加2個(gè)額外環(huán)引物的方式，加快該反應(yīng)的進(jìn)行。

　　2等溫?cái)U(kuò)增法的衍生技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

　　通常對(duì)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括肉眼觀察、凝膠電泳分離顯色法、實(shí)時(shí)濁度、實(shí)時(shí)熒光等，相比新方法，傳統(tǒng)方法具有靈敏度低或存在抑制放大現(xiàn)象等弊端，因此新的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用研究越發(fā)廣泛。如橫向試紙法、表面強(qiáng)度拉曼、微流控芯片技術(shù)等。

　　2.1橫向試紙法（Lateralflowdipstick,LFD）

　　LFD主要采用的是膠體金作為標(biāo)記物，借助核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速、便攜等優(yōu)勢(shì)，核酸等溫?cái)U(kuò)增-LFD技術(shù)在病原微生物的檢測(cè)，天津市疾控預(yù)防中心研究者將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與橫向擴(kuò)增相結(jié)合流試紙用于檢測(cè)布魯氏菌，并建立了一個(gè)快速布魯氏菌快速檢測(cè)方法。總程序時(shí)間僅需80min即可特異性檢測(cè)布魯氏菌，對(duì)純菌培養(yǎng)的檢測(cè)靈敏度達(dá)到5.4x100CFU/mL。LAMP-LFD方法能夠快速、特異地檢測(cè)布魯氏菌，且具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、直觀的優(yōu)勢(shì)。

　　早在2014年，寧波大學(xué)生物與海洋科學(xué)系王瑞娜等為了減少全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，建立了基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和側(cè)流聯(lián)合的豬鏈球菌視覺(jué)檢測(cè)試紙方法，該研究采用LAMP-LFD快速檢測(cè)豬鏈球菌，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需40min，比常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)間縮短了2h。對(duì)豬鏈球菌純菌的檢出限為8.70x101CFU/mL(1.74CFU/reaction)。比LAMP高10倍，比常規(guī)PCR高100倍且具有良好的重復(fù)性。因此，LAMP-LED是一種準(zhǔn)確、省時(shí)、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

　　劉露及農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增聯(lián)合橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)草魚(yú)呼腸孤病毒的方法，并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)進(jìn)行對(duì)比。從LAMP擴(kuò)增到LFD結(jié)果判讀共需50min，比qPCR檢測(cè)縮短近1h。

　　以上研究表明，LAMP和物美價(jià)廉的試紙條結(jié)合檢測(cè)致病菌不僅解決了單獨(dú)使用LFD靈敏度較低的缺點(diǎn)，也更加突出了核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速、方便的優(yōu)勢(shì)。LAMP-LFD技術(shù)在致病菌檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展迅速且涉及面廣使得LAMP-LFD技術(shù)受到越來(lái)越多專(zhuān)業(yè)人士的青睞，其進(jìn)一步的研究開(kāi)發(fā)依然非常迫切。

　　2.2表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhancedRamanscattering,SERS）

　　表面增強(qiáng)拉曼光譜是使用拉曼活性金納米探針檢測(cè)細(xì)菌的DNA。結(jié)合LAMP擴(kuò)增目標(biāo)DNA，用金納米粒子組成的金納米探針進(jìn)行標(biāo)記，用特異性的探針修飾，使SERS能夠檢測(cè)到目標(biāo)DNA。

　　ShehataDM等研究人員開(kāi)發(fā)了一種集成的檢測(cè)方法，將環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)結(jié)合起來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌，此檢測(cè)方法的靈敏度比傳統(tǒng)的PCR方法高100倍。值得注意的是，這項(xiàng)技術(shù)可以對(duì)腸道鏈球菌的目標(biāo)DNA進(jìn)行高度特異性檢測(cè)，并將其與密切相關(guān)的細(xì)菌或非特異性污染的DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)，使其比標(biāo)準(zhǔn)LAMP技術(shù)更準(zhǔn)確可靠，同時(shí)研究驗(yàn)證了LAMP-SERS法在牛奶樣品中檢測(cè)腸桿菌的適用性。LAMP-SERS具有較高的特異性和敏感性，在快速檢測(cè)不同食源性致病菌和其他微生物污染物方面有極大的潛力。

　　2.3微流控芯片技術(shù)（micro-fluidics,MF）

　　微流控芯片是一種在20世紀(jì)80年代興起的能夠精準(zhǔn)操做控制的微尺度流體技術(shù)。其將化學(xué)分析儀器微型化與集成化，盡可能地把分析設(shè)備的功能聚集到芯片上。

　　JUHepeng等人建立LAMP微流控芯片快速檢測(cè)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的方法。用儀器或肉眼對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，用標(biāo)準(zhǔn)菌株測(cè)試了芯片的敏感性和特異性，用污染樣品對(duì)芯片的敏感性進(jìn)行了第二次驗(yàn)證。結(jié)果表明，該芯片具有較高的靈敏度和特異性，三種病原菌檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到102CFU/mL。藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院研究者通過(guò)設(shè)計(jì)芯片結(jié)構(gòu)、優(yōu)化進(jìn)樣模式及檢測(cè)方式，實(shí)現(xiàn)了病原微生物核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)一體化，并具備多重檢測(cè)、定量檢測(cè)等功能。以期為病原微生物的快速篩查提供更多的方案思路，提升公共衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)魅拘约膊〉姆揽啬芰Α?/p>

　　朱亞光與其同事探討恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片技術(shù)快速篩查關(guān)節(jié)結(jié)核感染的應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用恒溫?cái)U(kuò)增法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)19例疑似關(guān)節(jié)結(jié)核感染患者標(biāo)本進(jìn)行菌群鑒定，借助共焦濾波技術(shù)，熒光染料技術(shù)將標(biāo)本的核酸通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增法使結(jié)果量化，同時(shí)將標(biāo)本核酸結(jié)果比對(duì)陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照的核酸結(jié)果以此鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示恒溫?cái)U(kuò)增法檢測(cè)出13例陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為68.42%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)出7例陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為36.84%；由此得到恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片熒光檢測(cè)核酸技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地檢測(cè)可疑關(guān)節(jié)結(jié)核中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，可作為診斷篩查手段。

　　秦奎偉將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的微流控芯技術(shù)應(yīng)用在病原微生物沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)鑒定中，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)鑒定。其研發(fā)的新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增微流控芯片具備體積小、耗樣量少、分析快、反應(yīng)條件溫和、可視化檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可為食源性病原菌的快速檢測(cè)提供一種理想的方法。

　　3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用前景

　　目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于多種真菌、病毒、細(xì)菌以及分枝桿菌等病原微生物的診斷。該方法操作簡(jiǎn)單，儀器設(shè)備依賴性低，可快速、特異地檢測(cè)出病源微生物，尤其是LAMP-SERS分析具有較高的特異性和敏感性，具有快速檢測(cè)不同食源性致病菌和其他微生物污染物的潛力。微流控芯片技術(shù)是使用微管道進(jìn)行實(shí)驗(yàn)反應(yīng)和樣本檢測(cè)等，具有微型化、集成化等特點(diǎn)。根據(jù)通道的設(shè)計(jì)，可以在芯片上產(chǎn)生所需的微環(huán)境條件，利用微流控芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)短期內(nèi)數(shù)十甚至上百例樣本的同時(shí)鑒定。LAMP技術(shù)結(jié)合一些新技術(shù)改變了傳統(tǒng)檢測(cè)方法中的諸多不足，有望成為微生物現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的常規(guī)技術(shù)手段。

　　參考文獻(xiàn)：

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　　舒沿沿，鄭菲