摘要：采用拉曼光譜法對(duì)藥用植物丹參根鮮樣不同組織部位進(jìn)行原位檢測(cè)，以考察丹參酮類(lèi)成分在丹參根中不同組織上的分布。結(jié)果表明：丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品在1668、1620、1579、1535、1479cm-1出現(xiàn)較強(qiáng)峰，丹參根周皮、韌皮部也在1667/1665、1618/1613、1576/1575、1533/1532、1477/1480cm-1出現(xiàn)較強(qiáng)峰，周皮、韌皮部與丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品譜圖之間的匹配度分別為74.9%、49.4%;而木質(zhì)部與丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品無(wú)相對(duì)應(yīng)的拉曼峰，與隱丹參酮、二氫丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品譜圖之間的匹配度很低，分別僅為4.4%、5.6%，不足以證明有丹參酮類(lèi)成分存在;因此得出丹參根周皮和韌皮部中均有丹參酮類(lèi)成分的分布，且主要成分為丹參酮IIA，而木質(zhì)部中無(wú)丹參酮類(lèi)成分分布的結(jié)論。雖然丹參根周皮和木質(zhì)部均呈紅色，但拉曼光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)丹參酮類(lèi)成分的分布與周皮細(xì)胞顏色分布之間呈正相關(guān)性，與木質(zhì)部細(xì)胞顏色分布無(wú)相關(guān)性，這提示顏色判別法分析丹參酮類(lèi)成分的分布具有一定的局限性，而利用拉曼光譜法可快速的獲得丹參酮類(lèi)成分在丹參根中的分布情況，凸顯了拉曼光譜用于丹參根中化學(xué)成分原位檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

　　關(guān)鍵詞：丹參根;拉曼光譜;原位檢測(cè);丹參酮類(lèi)成分

　　1引言

　　中藥丹參是唇形科植物丹參(Salviamiltior-rhizaBge.)的干燥根及根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效，在臨床上被廣泛用于心腦血管疾病的治療[1]。丹參中主要的活性成分包括脂溶性成分和水溶性成分，其中丹參酮類(lèi)成分是丹參中主要的脂溶性成分，為心腦血管疾病治療的主要藥效物質(zhì)[2]，在丹參植物體內(nèi)的合成與積累具有固定的部位[3]。常用的測(cè)定丹參根中丹參酮類(lèi)成分的方法是高效液相色譜法(HPLC)[4]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)[5]，這些方法需要復(fù)雜的樣品制備和提取過(guò)程，且難以表現(xiàn)不同組織部位化學(xué)成分的空間分布特征。本文利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)藥用植物丹參根部不同組織部位的丹參酮類(lèi)成分進(jìn)行原位、快速分析，以考察丹參酮類(lèi)成分在不同組織部位中的分布情況，為進(jìn)一步對(duì)丹參酮類(lèi)成分的積累規(guī)律和生物合成研究提供支撐。

　　2實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1儀器設(shè)備

　　DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀(DXRRamanMicroscope，ThermoFisherScientific公司)，激發(fā)波長(zhǎng)780nm，激光能量24mW，采集曝光時(shí)間3s，樣品曝光次數(shù)30，針孔光闌50!m，50倍物鏡(數(shù)值孔徑0.5!m)，光譜采集范圍為200～3200cm-1，光譜分辨率為4cm-1。

　　2.2樣品來(lái)源與制片

　　樣品丹參來(lái)源于四川中江，種植于成都中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)。取樣后，洗凈、用徒手切片法切薄片(厚度約1mm)，蒸餾水裝片，供拉曼光譜檢測(cè)。另取同部位，切約0.1mm薄片，在光鏡下確定橫切面各細(xì)胞組織的分布。

　　2.3丹參酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品

　　丹參酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮等均購(gòu)自于成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≧98%。

　　相關(guān)論文推薦：淺析丹參酮ⅡA磺酸鈉細(xì)菌

　　【摘 要】目的建立檢測(cè)注射用丹參酮ⅡA磺酸鈉中內(nèi)毒素的試驗(yàn)方法。方法運(yùn)用干擾初篩法對(duì)供試品進(jìn)行干擾試驗(yàn)，采用鱟試劑法對(duì)樣品中的內(nèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果注射用丹參酮ⅡA磺酸鈉在藥液稀釋濃度為0.016 8 mg·ml-1以下時(shí)，與鱟試劑反應(yīng)無(wú)干擾。結(jié)論所采用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法可用于注射用丹參酮ⅡA磺酸鈉的內(nèi)毒素檢查。

　　3結(jié)果與討論

　　3.1丹參酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜特征

　　丹參酮類(lèi)成分屬于二萜類(lèi)化合物，丹參中主要的丹參酮類(lèi)成分化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1;其拉曼譜圖見(jiàn)圖2，其中圖2(a)為丹參酮IIA的拉曼光譜，共有24條譜線(xiàn)，在1668、1620、1579、1535、1479、1427、1402、1283、1206、1191、1072、1027cm-1有明顯的拉曼特征峰;圖2(b)為丹參酮I的拉曼光譜，共有25條譜線(xiàn)，在1658、1599、1546、1472、1427、1355、1207、1186、1067cm-1有明顯的拉曼特征峰;圖2(c)為隱丹參酮的拉曼光譜，共有25條譜線(xiàn)，在1682、1617、1581、1458、1414、1370、1298、1193、1164、1139、1027cm-1有明顯的拉曼特征峰;圖2(d)為二氫丹參酮的拉曼光譜，共有20條譜線(xiàn)，在1682、1626、1561、1467、1417、1363、1350、1293、1182cm-1有明顯的拉曼特征峰。早期的紅外光譜研究指出丹參酮類(lèi)成分的特征峰出現(xiàn)在4000～1350cm-1區(qū)域內(nèi)，指紋峰出現(xiàn)在1350～400cm-1區(qū)域內(nèi)，位于1701、1650cm-1等位置的吸收峰為羰基的振動(dòng)頻率，位于1381、1361cm-1等位置的吸收峰為A環(huán)上甲基的振動(dòng)頻率，位于1685、1665、1635cm-1等位置的吸收峰為萘醌的振動(dòng)頻率，位于1025cm-1等位置的吸收峰為呋喃環(huán)的振動(dòng)頻率[6]。由于紅外峰與拉曼峰的互補(bǔ)性，這些紅外特征信息可作為判斷拉曼光譜中是否含有丹參酮類(lèi)成分的參考依據(jù)。同時(shí)用所獲得的丹參酮類(lèi)成分拉曼譜圖建立標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)。結(jié)合丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼特征峰以及與標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，用于研究丹參根中不同組織部位丹參酮類(lèi)成分的分布情況。

　　3.2丹參根不同組織部位的拉曼光譜檢測(cè)

　　3.2.1丹參根不同組織部位丹參酮類(lèi)成分的分布情況

　　將樣品置于顯微鏡下，調(diào)焦清楚后將激光聚焦到不同組織部位(見(jiàn)圖3)，得到不同組織部位的拉曼光譜，如圖4的a、b、c所示。

　　(1)丹參根不同組織的拉曼特征峰分析

　　由圖4(a)和4(b)可知，丹參根周皮和韌皮部拉曼特征峰的波數(shù)基本一致;與圖2對(duì)比，發(fā)現(xiàn)其與圖2(a)十分相似，由圖可見(jiàn)，丹參根周皮、韌皮部及丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品均在1667/1665/1668、1618/1613/1620、1576/1575/1579、1533/1532/1535、1477/1480/1479cm-1出現(xiàn)較強(qiáng)峰，在1207/1208/1207、1072/1069/1072、1026/1025/1027、699/699/699、520/520/521cm-1出現(xiàn)中等強(qiáng)度的峰，其中1667/1665/1668歸屬于萘醌的伸縮振動(dòng)峰，1026/1025/1027歸屬于呋喃環(huán)的伸縮振動(dòng)峰，其它拉曼峰的產(chǎn)生受丹參酮母核結(jié)構(gòu)上所連接的不同官能團(tuán)影響[6]，據(jù)此可以判斷丹參根周皮和韌皮部中有丹參酮IIA的分布，從峰強(qiáng)度來(lái)看，丹參根周皮的峰強(qiáng)度大于韌皮部，說(shuō)明周皮中的丹參酮IIA含量高于韌皮部，與已有的研究結(jié)果相符[4，7]。圖4(c)表明，丹參根木質(zhì)部產(chǎn)生的拉曼信息很少，僅出現(xiàn)了1個(gè)拉曼峰，且從譜圖對(duì)應(yīng)情況來(lái)看，沒(méi)有與丹參酮類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的拉曼峰，說(shuō)明丹參根木質(zhì)部中可能沒(méi)有丹參酮類(lèi)成分的分布。

　　(2)丹參根不同組織的拉曼譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品譜圖對(duì)比獲得的樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，OMNIC軟件計(jì)算得出相似度，結(jié)果見(jiàn)表1。

　　與標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)對(duì)比結(jié)果表明，丹參根周皮、韌皮部與丹參酮IIA標(biāo)準(zhǔn)品譜圖之間的匹配度分別為74.9%、49.4%，與隱丹參酮也有一定的匹配度，說(shuō)明丹參根周皮和韌皮部中有丹參酮類(lèi)成分的分布，且主要成分為丹參酮IIA。而木質(zhì)部與丹參酮類(lèi)成分的匹配度很低，與隱丹參酮、二氫丹參酮標(biāo)準(zhǔn)品譜圖之間的匹配度分別僅為4.4%、5.6%，不足以證明木質(zhì)部中有丹參酮類(lèi)成分存在，因此得出丹參根木質(zhì)部中無(wú)丹參酮類(lèi)成分分布的結(jié)論。

　　植物次生代謝產(chǎn)物通過(guò)次生代謝途徑產(chǎn)生，因其特定的生物學(xué)功能和固有的細(xì)胞毒性而特異性地分布在植物體不同組織部位中[9]。本文利用拉曼光譜法對(duì)丹參酮類(lèi)成分在丹參根中的組織特異性分布研究結(jié)果與段增強(qiáng)[10]、趙希賢[8]、李進(jìn)瞳[11]等利用HPLC、組織化學(xué)定位方法研究結(jié)果相吻合。另外利用紫外分光光度法和紅外光譜法也可以檢測(cè)丹參酮類(lèi)成分。應(yīng)用HPLC、紫外分光光度法來(lái)確定丹參酮類(lèi)成分在丹參根中的分布是一種有效的研究手段，但其工作量大、操作繁瑣、耗時(shí)耗工，且無(wú)法快速獲得化學(xué)成分與空間分布之間的信息;而組織化學(xué)定位法、紅外光譜法需要樣品處理，且紅外光譜法對(duì)水等極性物質(zhì)敏感，不能檢測(cè)新鮮含水樣品。由于激光拉曼光譜具有靈敏度高、檢測(cè)限低、簡(jiǎn)便快速、原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，且不受水的干擾[12-13]，因而彌補(bǔ)了其不足之處。

　　3.2.2丹參根不同組織細(xì)胞顏色與丹參酮類(lèi)成分分布之間的相關(guān)性

　　對(duì)不同顏色的周皮細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，所得拉曼譜圖如圖5所示，與丹參酮類(lèi)成分標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)對(duì)比的結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)木質(zhì)部的不同細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，所得拉曼譜圖如圖6所示，與丹參酮類(lèi)成分標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表3。

　　由圖5可知，周皮細(xì)胞顏色呈圖5(a)時(shí)，在拉曼譜圖上顯示出較多、較強(qiáng)的特征峰，而細(xì)胞顏色過(guò)渡至圖5(d)時(shí)，拉曼譜圖中特征峰減少、強(qiáng)度變?nèi)?表2結(jié)果表明，圖5(a)拉曼光譜與丹參酮類(lèi)成分之間的匹配度較高，至圖5(d)時(shí)匹配度逐漸降低。由圖6可知，木質(zhì)部細(xì)胞在4000～1350cm-1內(nèi)均未出現(xiàn)由丹參酮官能團(tuán)伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的拉曼特征峰;表3結(jié)果表明，圖6拉曼光譜與丹參酮類(lèi)成分之間的匹配度較低。綜上可知，在丹參根周皮中，丹參酮類(lèi)成分的分布與周皮細(xì)胞顏色分布之間呈正相關(guān)性，即周皮中，細(xì)胞紅色強(qiáng)度越強(qiáng)的部位，丹參酮類(lèi)成分含量越高;反之，則含量越低;而木質(zhì)部細(xì)胞顏色與丹參酮類(lèi)成分的分布沒(méi)有直接的相關(guān)性。

　　丹參酮IIA為丹參中主要的脂溶性成分，呈桔紅色結(jié)晶狀;丹參中其它的脂溶性成分大多亦表現(xiàn)為紅色。自古以來(lái)，丹參藥材的顏色性狀在藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中就具有重要的地位，依據(jù)“皮丹而肉紫”的評(píng)價(jià)指標(biāo)，王海[14]等利用色彩色差計(jì)法和HPLC方法判定丹參細(xì)胞顏色與丹參酮類(lèi)成分之間的關(guān)系，以期闡釋丹參顏色性狀鑒別的合理性，結(jié)果表明丹參藥材表面顏色與其脂溶性成分呈正相關(guān)。而本文研究結(jié)果顯示，丹參酮類(lèi)成分的分布只在周皮中與細(xì)胞顏色呈正相關(guān)性，而在木質(zhì)部中，與丹參酮類(lèi)成分的分布沒(méi)有直接的相關(guān)性。這提示，顏色法判別丹參酮類(lèi)成分的分布具有一定的局限性。

　　4結(jié)論

　　本研究結(jié)合丹參酮類(lèi)成分標(biāo)準(zhǔn)品拉曼信息以及與標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，從而判斷丹參根中不同組織部位丹參酮類(lèi)成分的分布情況。結(jié)果表明，丹參根周皮和韌皮部中均有丹參酮類(lèi)成分的分布，且主要成分為丹參酮IIA，而木質(zhì)部中無(wú)丹參酮類(lèi)成分分布。同時(shí)，對(duì)丹參根周皮和木質(zhì)中不同細(xì)胞進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)丹參酮類(lèi)成分的分布與周皮細(xì)胞顏色分布之間呈正相關(guān)性，與木質(zhì)部細(xì)胞顏色分布無(wú)相關(guān)性。因此，拉曼光譜法可以快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地原位檢測(cè)丹參酮類(lèi)成分在丹參根不同組織中的特異性分布情況。