摘要：采用拉曼光譜法對藥用植物丹參根鮮樣不同組織部位進行原位檢測，以考察丹參酮類成分在丹參根中不同組織上的分布。結果表明：丹參酮IIA標準品在1668、1620、1579、1535、1479cm-1出現較強峰，丹參根周皮、韌皮部也在1667/1665、1618/1613、1576/1575、1533/1532、1477/1480cm-1出現較強峰，周皮、韌皮部與丹參酮IIA標準品譜圖之間的匹配度分別為74.9%、49.4%;而木質部與丹參酮IIA標準品無相對應的拉曼峰，與隱丹參酮、二氫丹參酮標準品譜圖之間的匹配度很低，分別僅為4.4%、5.6%，不足以證明有丹參酮類成分存在;因此得出丹參根周皮和韌皮部中均有丹參酮類成分的分布，且主要成分為丹參酮IIA，而木質部中無丹參酮類成分分布的結論。雖然丹參根周皮和木質部均呈紅色，但拉曼光譜檢測發現丹參酮類成分的分布與周皮細胞顏色分布之間呈正相關性，與木質部細胞顏色分布無相關性，這提示顏色判別法分析丹參酮類成分的分布具有一定的局限性，而利用拉曼光譜法可快速的獲得丹參酮類成分在丹參根中的分布情況，凸顯了拉曼光譜用于丹參根中化學成分原位檢測的優勢。

　　關鍵詞：丹參根;拉曼光譜;原位檢測;丹參酮類成分

　　1引言

　　中藥丹參是唇形科植物丹參(Salviamiltior-rhizaBge.)的干燥根及根莖，具有活血化瘀、通經止痛、清心除煩等功效，在臨床上被廣泛用于心腦血管疾病的治療[1]。丹參中主要的活性成分包括脂溶性成分和水溶性成分，其中丹參酮類成分是丹參中主要的脂溶性成分，為心腦血管疾病治療的主要藥效物質[2]，在丹參植物體內的合成與積累具有固定的部位[3]。常用的測定丹參根中丹參酮類成分的方法是高效液相色譜法(HPLC)[4]和液相色譜串聯質譜法(LC-MS)[5]，這些方法需要復雜的樣品制備和提取過程，且難以表現不同組織部位化學成分的空間分布特征。本文利用拉曼光譜技術對藥用植物丹參根部不同組織部位的丹參酮類成分進行原位、快速分析，以考察丹參酮類成分在不同組織部位中的分布情況，為進一步對丹參酮類成分的積累規律和生物合成研究提供支撐。

　　2實驗部分

　　2.1儀器設備

　　DXR激光共焦顯微拉曼光譜儀(DXRRamanMicroscope，ThermoFisherScientific公司)，激發波長780nm，激光能量24mW，采集曝光時間3s，樣品曝光次數30，針孔光闌50!m，50倍物鏡(數值孔徑0.5!m)，光譜采集范圍為200～3200cm-1，光譜分辨率為4cm-1。

　　2.2樣品來源與制片

　　樣品丹參來源于四川中江，種植于成都中醫藥大學藥用植物園內。取樣后，洗凈、用徒手切片法切薄片(厚度約1mm)，蒸餾水裝片，供拉曼光譜檢測。另取同部位，切約0.1mm薄片，在光鏡下確定橫切面各細胞組織的分布。

　　2.3丹參酮類標準品

　　丹參酮類標準品丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮、二氫丹參酮等均購自于成都普菲德生物技術有限公司，純度≧98%。

　　相關論文推薦：淺析丹參酮ⅡA磺酸鈉細菌

　　【摘 要】目的建立檢測注射用丹參酮ⅡA磺酸鈉中內毒素的試驗方法。方法運用干擾初篩法對供試品進行干擾試驗，采用鱟試劑法對樣品中的內毒素進行檢測。 結果注射用丹參酮ⅡA磺酸鈉在藥液稀釋濃度為0.016 8 mg·ml-1以下時，與鱟試劑反應無干擾。結論所采用的細菌內毒素檢查法可用于注射用丹參酮ⅡA磺酸鈉的內毒素檢查。

　　3結果與討論

　　3.1丹參酮類標準品的拉曼光譜特征

　　丹參酮類成分屬于二萜類化合物，丹參中主要的丹參酮類成分化學結構式見圖1;其拉曼譜圖見圖2，其中圖2(a)為丹參酮IIA的拉曼光譜，共有24條譜線，在1668、1620、1579、1535、1479、1427、1402、1283、1206、1191、1072、1027cm-1有明顯的拉曼特征峰;圖2(b)為丹參酮I的拉曼光譜，共有25條譜線，在1658、1599、1546、1472、1427、1355、1207、1186、1067cm-1有明顯的拉曼特征峰;圖2(c)為隱丹參酮的拉曼光譜，共有25條譜線，在1682、1617、1581、1458、1414、1370、1298、1193、1164、1139、1027cm-1有明顯的拉曼特征峰;圖2(d)為二氫丹參酮的拉曼光譜，共有20條譜線，在1682、1626、1561、1467、1417、1363、1350、1293、1182cm-1有明顯的拉曼特征峰。早期的紅外光譜研究指出丹參酮類成分的特征峰出現在4000～1350cm-1區域內，指紋峰出現在1350～400cm-1區域內，位于1701、1650cm-1等位置的吸收峰為羰基的振動頻率，位于1381、1361cm-1等位置的吸收峰為A環上甲基的振動頻率，位于1685、1665、1635cm-1等位置的吸收峰為萘醌的振動頻率，位于1025cm-1等位置的吸收峰為呋喃環的振動頻率[6]。由于紅外峰與拉曼峰的互補性，這些紅外特征信息可作為判斷拉曼光譜中是否含有丹參酮類成分的參考依據。同時用所獲得的丹參酮類成分拉曼譜圖建立標準拉曼譜圖庫。結合丹參酮標準品的拉曼特征峰以及與標準拉曼譜圖庫進行對比，用于研究丹參根中不同組織部位丹參酮類成分的分布情況。

　　3.2丹參根不同組織部位的拉曼光譜檢測

　　3.2.1丹參根不同組織部位丹參酮類成分的分布情況

　　將樣品置于顯微鏡下，調焦清楚后將激光聚焦到不同組織部位(見圖3)，得到不同組織部位的拉曼光譜，如圖4的a、b、c所示。

　　(1)丹參根不同組織的拉曼特征峰分析

　　由圖4(a)和4(b)可知，丹參根周皮和韌皮部拉曼特征峰的波數基本一致;與圖2對比，發現其與圖2(a)十分相似，由圖可見，丹參根周皮、韌皮部及丹參酮IIA標準品均在1667/1665/1668、1618/1613/1620、1576/1575/1579、1533/1532/1535、1477/1480/1479cm-1出現較強峰，在1207/1208/1207、1072/1069/1072、1026/1025/1027、699/699/699、520/520/521cm-1出現中等強度的峰，其中1667/1665/1668歸屬于萘醌的伸縮振動峰，1026/1025/1027歸屬于呋喃環的伸縮振動峰，其它拉曼峰的產生受丹參酮母核結構上所連接的不同官能團影響[6]，據此可以判斷丹參根周皮和韌皮部中有丹參酮IIA的分布，從峰強度來看，丹參根周皮的峰強度大于韌皮部，說明周皮中的丹參酮IIA含量高于韌皮部，與已有的研究結果相符[4，7]。圖4(c)表明，丹參根木質部產生的拉曼信息很少，僅出現了1個拉曼峰，且從譜圖對應情況來看，沒有與丹參酮類標準品相對應的拉曼峰，說明丹參根木質部中可能沒有丹參酮類成分的分布。

　　(2)丹參根不同組織的拉曼譜圖與標準品譜圖對比獲得的樣品譜圖與標準拉曼譜圖庫進行對比，OMNIC軟件計算得出相似度，結果見表1。

　　與標準拉曼譜圖庫對比結果表明，丹參根周皮、韌皮部與丹參酮IIA標準品譜圖之間的匹配度分別為74.9%、49.4%，與隱丹參酮也有一定的匹配度，說明丹參根周皮和韌皮部中有丹參酮類成分的分布，且主要成分為丹參酮IIA。而木質部與丹參酮類成分的匹配度很低，與隱丹參酮、二氫丹參酮標準品譜圖之間的匹配度分別僅為4.4%、5.6%，不足以證明木質部中有丹參酮類成分存在，因此得出丹參根木質部中無丹參酮類成分分布的結論。

　　植物次生代謝產物通過次生代謝途徑產生，因其特定的生物學功能和固有的細胞毒性而特異性地分布在植物體不同組織部位中[9]。本文利用拉曼光譜法對丹參酮類成分在丹參根中的組織特異性分布研究結果與段增強[10]、趙希賢[8]、李進瞳[11]等利用HPLC、組織化學定位方法研究結果相吻合。另外利用紫外分光光度法和紅外光譜法也可以檢測丹參酮類成分。應用HPLC、紫外分光光度法來確定丹參酮類成分在丹參根中的分布是一種有效的研究手段，但其工作量大、操作繁瑣、耗時耗工，且無法快速獲得化學成分與空間分布之間的信息;而組織化學定位法、紅外光譜法需要樣品處理，且紅外光譜法對水等極性物質敏感，不能檢測新鮮含水樣品。由于激光拉曼光譜具有靈敏度高、檢測限低、簡便快速、原位檢測等優點，且不受水的干擾[12-13]，因而彌補了其不足之處。

　　3.2.2丹參根不同組織細胞顏色與丹參酮類成分分布之間的相關性

　　對不同顏色的周皮細胞進行檢測，所得拉曼譜圖如圖5所示，與丹參酮類成分標準拉曼譜圖庫對比的結果見表2。對木質部的不同細胞進行檢測，所得拉曼譜圖如圖6所示，與丹參酮類成分標準拉曼譜圖庫對比結果見表3。

　　由圖5可知，周皮細胞顏色呈圖5(a)時，在拉曼譜圖上顯示出較多、較強的特征峰，而細胞顏色過渡至圖5(d)時，拉曼譜圖中特征峰減少、強度變弱;表2結果表明，圖5(a)拉曼光譜與丹參酮類成分之間的匹配度較高，至圖5(d)時匹配度逐漸降低。由圖6可知，木質部細胞在4000～1350cm-1內均未出現由丹參酮官能團伸縮振動產生的拉曼特征峰;表3結果表明，圖6拉曼光譜與丹參酮類成分之間的匹配度較低。綜上可知，在丹參根周皮中，丹參酮類成分的分布與周皮細胞顏色分布之間呈正相關性，即周皮中，細胞紅色強度越強的部位，丹參酮類成分含量越高;反之，則含量越低;而木質部細胞顏色與丹參酮類成分的分布沒有直接的相關性。

　　丹參酮IIA為丹參中主要的脂溶性成分，呈桔紅色結晶狀;丹參中其它的脂溶性成分大多亦表現為紅色。自古以來，丹參藥材的顏色性狀在藥材質量評價中就具有重要的地位，依據“皮丹而肉紫”的評價指標，王海[14]等利用色彩色差計法和HPLC方法判定丹參細胞顏色與丹參酮類成分之間的關系，以期闡釋丹參顏色性狀鑒別的合理性，結果表明丹參藥材表面顏色與其脂溶性成分呈正相關。而本文研究結果顯示，丹參酮類成分的分布只在周皮中與細胞顏色呈正相關性，而在木質部中，與丹參酮類成分的分布沒有直接的相關性。這提示，顏色法判別丹參酮類成分的分布具有一定的局限性。

　　4結論

　　本研究結合丹參酮類成分標準品拉曼信息以及與標準拉曼譜圖庫進行對比，從而判斷丹參根中不同組織部位丹參酮類成分的分布情況。結果表明，丹參根周皮和韌皮部中均有丹參酮類成分的分布，且主要成分為丹參酮IIA，而木質部中無丹參酮類成分分布。同時，對丹參根周皮和木質中不同細胞進行拉曼光譜檢測，發現丹參酮類成分的分布與周皮細胞顏色分布之間呈正相關性，與木質部細胞顏色分布無相關性。因此，拉曼光譜法可以快速、簡便、準確地原位檢測丹參酮類成分在丹參根不同組織中的特異性分布情況。