摘要 通過體外模擬糖尿病患者高血糖環境研究胎盤間充質干細胞(placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)促進角質形成細胞的增殖和遷移能力, 這對闡明PMSCs促進糖尿病足等皮膚創傷修復的作用具有重要意義。該研究分離培養人角質形成細胞(human keratinocytes, hKCs), 添加 50~100 mmol/L葡萄糖, 建立高糖損傷模型。利用CCK-8檢測損傷hKCs與PMSCs共培養前后的增殖情況, 流式細胞術檢測細凋亡胞數量, 細胞劃痕愈合實驗檢測細胞遷移速度, 免疫熒光染色和 Western blot檢測細胞骨架蛋白波形蛋白(vimentin)的表達, 以反映細胞的形態和運動能力。結果發現, 原代hKCs為大小均一的鋪路石樣細胞, 在模擬高血糖環境(50 mmol/L、100 mmol/L D-葡萄糖) 時, 細胞出現扁平、增大、增殖能力下降等衰老特點, 角質形成細胞增殖率低, 遷移區域稀疏。與對照組相比, PMSCs共培養組在高糖條件下hKCs生長速度快, 增殖率高, 凋亡率低, 遷移覆蓋面積較大, 波形蛋白表達明顯增強, 形態發生間質樣轉變。以上結果說明, PMSCs不僅能夠抑制高糖引起的人角質形成細胞凋亡, 同時促進其增殖和遷移, 為間充質干細胞促進皮膚創面愈合的基礎與臨床研究提供了新證據。

　　關鍵詞 胎盤間充質干細胞; 人角質形成細胞; 增殖; 遷移; 高糖; 皮膚創面愈合

　　糖尿病性慢性難愈合創面嚴重影響患者健康和生活質量, 甚至發生致殘、潰瘍癌變等危及患者生命的嚴重并發癥。影響糖尿病創面愈合過程的因素包括: 受損的角質細胞遷移和增殖[1]、縫隙連接異常[2]、慢性炎癥[3]、血管生成受損[4]、氧化應激增加[5]以及基質金屬蛋白酶的異常表達[6]。表皮角質形成細胞的生理功能紊亂在糖尿病創面愈合不良中起著重要的作用。慢性高血糖引起的表皮角質形成細胞的氧化應激損傷、蛋白活性改變等, 嚴重影響細胞的增殖、分化、運動等生物學功能, 使潰瘍表面經久不愈。我們前期的研究發現, 人胎盤間充質干細胞(placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)能夠明顯促進小鼠糖尿病潰瘍創面的愈合、促進血管內皮細胞和肌細胞的再生, 但其作用機制仍不明確。本研究利用體外培養的原代表皮基底細胞制備高糖損傷模型, 通過與PMSCs的共培養, 闡明PMSCs促進糖尿病潰瘍皮膚創面愈合的細胞學機制。本研究對促進糖尿病足等難愈性創面愈合, 降低糖尿病足病患者的截肢率具有重要意義, 可為慢性糖尿病創面的治療和管理提供更有效和個性化的治療策略。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 人體組織來源 正常人皮膚組織來源于寧夏醫科大學總醫院泌尿外科行包皮環切手術后廢棄皮膚, 胎盤來源于寧夏醫科大學總醫院產科分娩產婦及家屬捐贈, 經醫院倫理學委員會批準且獲得患者知情同意。

　　1.1.2 主要試劑及儀器

　　CELLnTEC表皮細胞培養基購自CELLnTEC公司; MesenCult™-XF Medium無血清培養基購自Stemcell公司; TrypLE Express消化酶、DNase I酶、Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒購自ThermoFisher公司; II型dispease酶購自Roche公司; CCK-8試劑購自Transgen Biotech公司; 倒置熒光顯微鏡為Olympus公司產品; CO2培養箱為ThermoFisher公司產品; 酶標儀為Bio-Rad公司產品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 胎兒來源的胎盤間充質干細胞的分離培養取新鮮胎盤組織, 利用剪刀分別小心避開血管, 剪取胎盤絨毛膜組織, 清洗后, 利用眼科剪機械破碎組織, 收集剪碎后的組織加入30 mL DMEM并加入 A型膠原酶和DNase I酶, 37 °C水浴消化2 h, 待消化完畢后將離心管置于離心機中按1 500 r/min的轉速離心, 用PBS重懸沉淀物, 先后用100 μm、40 μm細胞篩過濾沉淀, 收集過濾后所得細胞懸液, 離心后用 MesenCult™-XF Medium無血清培養基重懸, 接種于10 cm無菌培養皿中, 置于37 °C、5% CO2條件下培養, 每隔2天換液1次, 此細胞即為P0代。顯微鏡下觀察細胞生長狀態, 待細胞達70%~80%融合狀態時, 利用TrypLE消化后按1?3傳代, 繼續培養至P3代作為實驗用細胞。

　　1.2.2 hKCs分離培養 取環狀切除術后正常人包皮皮膚, 將組織先后在碘伏與75%的乙醇中消毒, 并在含1%抗生素的PBS中進行漂洗; 剔除皮下脂肪層、血管、結締組織, 剪成1 cm×1 cm小塊, 置于3.3 mg/ mL dispase II中, 4 °C消化14 h, 機械分開表皮與真皮層。將表皮置于離心管中, 加入0.25%胰酶5 mL, 在 37 °C孵箱中消化15 min。加DMEM+10% FBS終止消化, 1 500 r/min離心5 min, 棄上清, 加入無血清角化培養基, 在斡旋器上瞬時震蕩。70 μm無菌濾網過濾, 吸取單細胞懸液, 3×106 接種在已包被0.1% I型牛膠原的培養皿中, 置于37 °C、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養。待細胞長成70%~80%融合狀態時, 用TrypLE消化細胞5 min, PBS稀釋消化液終止消化, 吹打混懸, 離心收集細胞, 加培養基, 轉移至I型膠原包被好的培養皿內, 繼續培養至P2代, 每2天換液。

　　1.2.3 高糖損傷細胞模型構建 正常hKCs培養基含葡萄糖12.5 mmol/L, 在此基礎上添加D-葡萄糖(Dglucose), 使培養基中葡萄糖終濃度達到25 mmol/L、 50 mmol/L和100 mmol/L, 培養72 h后進行后續PMSC 條件培養基培養、劃痕、凋亡等實驗。

　　1.2.4 條件培養基的制備 1×106 的PMSCs貼壁培養12 h后, 換hKCs培養基繼續培養24 h收集培養上清, 0.45 μm濾膜過濾, 作為條件培養基繼續用于 CCK-8檢測hKCs細胞增殖。

　　1.2.5 共培養系統 利用膜孔徑為0.4 μm的Transwell小室進行兩種細胞共培養, 下室接種hKCs, 上室接種PMSCs, 共培養于含2%人血小板裂解物的 CELLnTEC表皮細胞培養基中, 各組分別添加不同濃度的葡萄糖。共培養72 h后, 用流式細胞分析 hKCs細胞凋亡, 免疫熒光分析vimentin蛋白表達, 劃痕愈合實驗分析細胞遷移能力。

　　1.2.6 CCK-8檢測細胞增殖 以TrypLE Express消化處于對數生長期的人hKCs, 細胞計數板計數, 以每100 μL接種于96孔板中(細胞密度3 000個/孔), 在 37 °C、5% CO2恒溫培養箱中培養2 h后, 即細胞貼壁后, 兩組各取6孔細胞, 每孔加入10 μL CCK-8溶液, 繼續在37 °C恒溫培養箱中孵育4 h后, 酶標儀檢測450 nm波長處各孔的D值。96孔板置于37 °C、5% CO2的恒溫培養箱中繼續培養1~7天, 每24 h測6個復孔, 并設無細胞的空白對照組。上述實驗均重復3次, 結果取平均值。根據公式計算各組細胞群體倍增時間, Td=δt×lg2/(lgNt–lgN0)。

　　1.2.7 流式法檢測細胞凋亡 收集正常培養、高糖培養和高糖損傷后再與PMSCs共培養的各組細胞, 消化離心后, PBS漂洗1次, 按Annexin V-FITC流式細胞分析試劑盒說明染色, 染色后, PBS漂洗1次, 上流式細胞儀分析細胞Annexin V和FITC陽性率。

　　1.2.8 劃痕愈合試驗 培養板背面畫橫線標記, 拍照時方便定位同一個視野。細胞鋪滿板底后, 用10 μL 槍頭垂直于孔板制造細胞劃痕, 盡量保證各個劃痕寬度一致。吸去細胞培養液, 用PBS沖洗孔板3次, 洗去劃痕產生的細胞碎片。加入無血清培養基, 每 12 h拍照記錄, 根據收集圖片數據分析細胞覆蓋面積和劃痕面積。

　　1.2.9 免疫熒光染色 各處理組細胞經40 g/L多聚甲醛固定30 min, 3 mL/L Triton X-100細胞膜穿孔10 min, 根據二抗選擇兔血清封閉, 次序與單克隆抗體 vimentin(1?200)一抗以及Alexa Fluor 488標記兔抗鼠二抗(1?1 000)孵育、洗滌, DAPI染核, 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞特異性發光情況, Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行陽性細胞計數。

　　1.2.10 Western blot 分析 RIPA裂解液提取樣本總蛋白, BCA法測定蛋白質濃度, 等量上樣, SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白, 濕法轉膜后, 5%脫脂奶粉封閉1 h, 次序與一抗(4 °C過夜)、二抗孵育(室溫30 min), 利用ECL法檢測目的蛋白條帶, 灰度掃描后分析蛋白質表達水平的差異。使用Image Pro Plus 6.0專業圖像分析軟件進行圖像分析, 用GAPDH標準化蛋白表達量。

　　1.2.11 統計學處理 所有實驗進行了3次重復。數據由SPSS 17.0或GraphPad軟件統計分析, 以均數 ±標準差(x _ ±s)表示應用統計學軟件對實驗結果進行單因素方差分析或雙因素方差分析, P<0.05為差異具有統計學意義。

　　2 結果

　　2.1 高糖損傷細胞模型建立及胎盤間充質干細胞對hKCs增殖的影響

　　12.5、25、50、100 mmol/L的D-glucose分別處理原代分離的hKCs 72 h后于倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。隨著D-glucose濃度的升高, 細胞形態發生了顯著變化(圖1)。對照組細胞為多邊形, 隨著培養時間的延長細胞數量增多; 12.5 mmol/L和25 mmol/L D-glucose處理細胞72 h后, 細胞仍然處于增殖狀態, 細胞形態基本無變化(圖1A和圖1B); 50 mmol/L D-glucose處理組部分細胞折光性降低, 胞體變大, 細胞胞體中出現空洞(圖1C); 100 mmol/L處理組大部分細胞變大, 邊緣模糊, 少量細胞失去貼壁性, 細胞周圍有典型凋亡小體溢出(圖1D)。

　　進一步采用CCK-8法檢測了高濃度D-glucose 對hKCs 7天內的生長抑制作用以及胎盤間充質干細胞條件培養基對hKCs增殖抑制的影響(圖2)。 50~100 mmol/L D-glucose對細胞有一定的細胞毒活性, 細胞增殖在處理24 h后明顯被抑制(圖2A), 群體倍增時間(PDT)較12~25 mmol/L葡萄糖濃度培養顯著延長(P<0.05)(圖2B)。而同樣糖濃度下, 使用胎盤間充質干細胞條件培養24 h后的培養基培養的hKCs 在 第5~7天, 增殖較50~100 mmol/L D-glucose對 照組明顯增加, 其他時間點沒有顯著差異。從群體倍增時間來看, PMSC-CM培養的hKCs的PDT減少, 25 mmol/L葡萄糖組差異顯著(P<0.05), 其他差異沒有統計學意義(圖2B)。

　　2.2 胎盤間充質干細胞對hKCs凋亡的影響

　　12.5、25、50、100 mmol/L D-glucose處理 hKCs 72 h后, 收集細胞進行Annexin V/FITC雙染流式檢測, 其結果顯示, 不同濃度D-glucose處理后, 50、 100 mmol/L D-glucose組凋亡細胞數量增加, 達到極顯著水平(P<0.01)(圖3和表1)。與胎盤間充質干細胞共培養后, 50~100 mmol/L葡萄糖處理的細胞, 凋亡細胞數量顯著低于未進行共培養的高糖損傷組 (P<0.05), 而12.5~25 mmol/L D-glucose處理組, 共培養前后凋亡細胞數差異不顯著。

　　2.3 胎盤間充質干細胞對hKCs遷移的影響

　　劃痕法觀察細胞的遷移情況, Image Pro Plus 軟件計算劃痕區域的面積(以像素計算)。對照組細胞在培養24 h后逐漸向劃痕遷移, 48 h后大部分細胞已遷移至劃痕處, 并越過劃痕形成兩界融合(圖 4A)。與12.5 mmol/L和25 mmol/L D-glucose組相比, 50 mmol/L和100 mmol/L葡萄糖處理hKCs 24 h和48 h后均顯示了較強的遷移抑制作用(P<0.01)。同時, 與 PMSCs共培養對細胞的遷移有顯著的促進作用, 差異具有統計學意義(P<0.05)(圖4B)。

　　2.4 胎盤間充質干細胞對hKCs波形纖維蛋白的影響

　　波形蛋白(vimentin, Vim)是一種III型中間絲(intermediate filament, IF)蛋白, 與細胞貼附性和運動性密切相關, 常被用作間質衍生細胞或細胞在上皮–間質轉化的標記。我們采用熒光二抗標記的免疫化學實驗觀察細胞形態變化(圖5A)。正常培養的hKCs, 波形蛋白分布聚集在細胞核周圍, 細胞以多邊形為主。胎盤間充質干細胞共培養72 h后, 沿細胞縱軸伸展出片狀偽足及絲狀偽足, 并相互接觸形成細胞間連接, 細胞形態向間質樣轉變。Western blot方法定量蛋白表達, 結果顯示, 與PMSCs共培養后, vimentin 相對GAPDH蛋白表達上調(圖5B), 相對灰度值統計結果差異顯著(圖5C)。

　　3 討論

　　糖尿病患者創面愈合損傷是一個重要的臨床問題。適當的角化細胞遷移和增殖是再上皮化的關鍵步驟, 這些自我修復過程在糖尿病(DM)中可能由于高血糖和傷口部位的慢性炎癥而受損[1]。本研究探討了高糖的類糖尿病微環境對人角質形成細胞體外遷移和增殖的影響以及胎盤來源間充質干細胞對高糖損傷的逆轉作用。高糖通過Erk信號通路以活性氧(ROS)依賴的方式刺激大鼠角質形成細胞遷移和增殖[7]。高血糖環境導致蛋白質的非酶糖基化增多, 如膠原蛋白的糖基化使角質形成細胞對糖基化I 型膠原的黏附和遷移減少。角質形成細胞中影響遷移的關鍵作用分子Gal-7基因的O-乙酰氨基葡萄糖 (O-GlcNAc)修飾增加, 降低了Gal-7的表達[8]。還有研究證明, 高糖通過抑制PI3K信號通路抑制ClC-2 氯離子通道, 減弱大鼠角質形成細胞的遷移[9]。基質金屬蛋白酶的異常表達也可能會導致角質形成細胞遷移受損, 導致糖尿病傷口的延遲愈合[6]。此外, 研究也顯示, 角質形成細胞功能障礙可能是由高糖誘導的氧化應激引起的[10-11]。動物實驗進一步證實, 氧化應激參與了糖尿病難愈合創面的形成, 口服抗氧化劑可以調節糖尿病小鼠的炎癥過程, 增強創面愈合[12]。以上研究表明, 多種機制導致了角質形成細胞在糖尿病中的增殖和遷移減少。本研究結果同樣顯示, 高糖會損害hKCs的增殖和遷移; 同時還表明, 與胎盤間充質干細胞共培養有利于恢復hKCs的增殖和遷移能力。已有的報道對高糖濃度的界定從25~100 mmol/L不等, 多數報道顯示, 30~50 mmol/L 葡萄糖會造成細胞損傷, 根據細胞類型不同存在差異[7,10,13]。本研究發現, 在25 mmol/L高糖培養下, 細胞增殖、凋亡和運動能力較12.5 mmol/L(正常hKCs培養基糖濃度)糖培養沒有明顯的差異。隨著糖濃度增加到50 mmol/L, hKCs增殖和運動能力都降低, 凋亡細胞比例升高。Buranasin等[10]也報道, 成纖維細胞在 50 mmol/L和75 mmol/L葡萄糖時, EdU染色陽性的細胞數量和細胞活力均下降, 高糖誘導的氧化應激會損害人牙齦成纖維細胞的增殖和遷移。雖然50 mmol/L 的糖濃度遠遠高于人糖尿病病理生理糖濃度, 但本研究中使用50 mmol/L的糖濃度才可檢測到細胞損傷, 這可能與細胞體外培養環境和檢測方法有關。

　　MSCs主要依賴于生長因子、細胞因子和外泌體等旁分泌效應對損傷組織起修復和免疫調節作用[14-16]。研究發現, 移植骨髓MSCs可以改善糖尿病大鼠的受損愈合過程, 這與減緩hKCs中pFAK水平下降以及MMP2、EGF、IGF-1水平升高有關[17]。用骨髓間充質干細胞治療大鼠角化細胞可以減少高糖誘導的ROS過量產生, 逆轉了由高糖誘導的MEK1/2 和Erk1/2磷酸化的下調[7]。Kato等[17]的研究發現, 移植BM-MSCs可以改善糖尿病大鼠的受損愈合過程, 在MSC-CM培養的角質形成細胞中, 高糖條件下 pFAK水平降低恢復, MMP2、EGF、IGF-1水平升高。胎盤間充質干細胞也具有來源廣泛、取材方便、低免疫原性以及可自體移植等優勢。已有研究發現, 胎盤來源MSCs可顯著促進傷口的愈合速度和血管數量[18]。本課題組前期研究也發現, 絨毛膜來源的PMSCs表達高水平的CD200和HGF。與HGF、 CD200陰性PMSCs相比, HGF、CD200陽性細胞在體外促進血管生成、提高小鼠體內免疫抑制功能方面具有顯著的潛力[19]。本研究驗證了PMSCs對高糖誘導的hKCs損傷的修復作用, 實驗發現, 高糖損傷的hKCs與PMSCs共培養(或條件培養)后凋亡細胞明顯減低、增殖顯著增加, 并且顯著促進了hKCs的遷移, 細胞形態發生明顯間質樣轉變, 細胞骨架蛋白 vimentin表達顯著上調。Vimentin在間充質細胞中形成中間絲, 促進細胞的上皮間質樣轉化, 被作為腫瘤進展的標記[20]。這些結果表明, PMSCs可以緩解高糖環境造成的hKCs增殖緩慢, 且促進hKCs的再生和運動能力。但PMSCs究竟通過何種蛋白和信號通路發揮促細胞遷移作用機制還需進一步研究。本研究在體外水平獨立分析了高糖條件下PMSCs對人角質形成細胞的功能影響,幼兒護理論文兇險型前置胎盤合并胎盤植入，為胎盤間充質干細胞對難愈合皮膚損傷的治療提供了一定的研究基礎。

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