論文《千島湖流域典型河流附石生物膜反硝化潛力及其微生物群落特征分析》發表在《環境科學學報》，本文來自網絡平臺，僅供參考。

　　摘要

　　生物膜是在水生態系統中具有相對穩定性的微生物及其代謝產物所組成的活性體系，在河流自凈過程中發揮著重要的作用。為了探究千島湖入湖河流礫石底質河床附石生物膜對水體氮素的脫除潛力及其影響因素，于2022-2023年選擇典型河流開展了春、夏、秋、冬4個季節野外調查，研究了附石生物膜生物量與反硝化潛力的時空變化及其影響因素，并結合高通量測序技術分析了附石生物膜的微生物群落結構。結果表明，水體溫度及營養鹽水平是影響附石生物膜生物量的重要因素，溫度最低的冬季附石生物膜生物量最低，營養鹽濃度高的點位附石生物膜生物量較高。附石生物膜的生物量是決定其反硝化速率的重要因素，生物量的增加提高了反硝化速率。此外，附石生物膜的反硝化速率與水體溫度、濁度呈顯著正相關((r=0.46)，(p<0.05);(r=0.49)，(p<0.05))，與水體溶解氧呈顯著負相關((r=-0.64)，(p<0.01))。紅細菌屬(Rhodobacter)是附石生物膜的優勢反硝化細菌屬，不動桿菌屬(Acinetobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)次之，氮濃度的增加以及溫度的升高刺激了反硝化細菌的生長。

　　關鍵詞

　　生物膜;反硝化;附石生物膜;千島湖流域

　　Characterization of denitrification potential of epilithic biofilm and its microbial community in typical rivers of Lake Qiandao

　　WANG Yuanyi¹,², XU Hai¹,²,*, ZHANG Zining¹,³, QIU Yu¹,², WU Mingjie¹,³, SUN Hongwei¹,³, LIU Yuxing¹,³, ZHU Guangwei¹, ZHU Mengyuan¹, QIN Boqiang¹, ZHANG Yunlin¹

　　1. Key Laboratory of Lake and Basin Water Safety, Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3. School of Environment and Ecology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

　　Abstract

　　Biofilm, consisting of relatively stable microorganisms and their metabolites, are integral in aquatic ecosystems, playing a significant role in the self-purification process of rivers. To explore the potential for nitrogen removal by periphyton attached to gravel bed substrate in the rivers flowing into Qiandao Lake and its influencing factors, spatiotemporal variation characteristics of water quality and periphyton biomass were invested from 2022 to 2023. Additionally, the denitrification potential of periphyton was measured through laboratory incubation experiments combined with membrane inlet mass spectrometry nitrogen-to-argon ratio analysis technology. High-throughput sequencing technology was employed to analyze the microbial community structure of the periphyton attached to stones. The results showed that water temperature and nutrient concentrations are important factors influencing the biomass of epilithic biofilm, with the lowest biomass in winter, and higher at nutrient-rich sites. The biomass of epilithic biofilm was an important factor in determining its denitrification rate, with higher biomass correlating with the enhanced denitrification rate. Furthermore, a significant positive correlation was found between the denitrification rate of epilithic biofilm and water temperature and turbidity((r=0.46)，(p<0.05);(r=0.49)，(p<0.05)), and a significant negative correlation with dissolved oxygen((r=-0.64)，(p<0.01)). Rhodobacter was the dominant denitrifying bacterial genus in the epilithic biofilm, followed by Acinetobacter and Sphingomonas, and denitrifying bacteria were stimulated by increased nitrogen concentration and rising temperatures.

　　Key words

　　biofilm;denitrification;attached microorganisms;Lake Qiandao Basin

　　1 引言(Introduction)

　　近年來，農業面源氮素污染已逐步成為部分河流與湖泊等水體的首要污染指標，嚴重威脅水生生態系統健康穩定。硝酸鹽具有較高的流動性，其被認為是流域內農業面源氮素污染的主要存在形式。高濃度硝態氮對水生植物和微生物具有毒性，長期飲用硝態氮超標的水也會引起嚴重的人類健康問題(Zhang et al., 2020b)，水體中硝態氮濃度過高也會造成藻類的異常增殖，嚴重時會發生水華現象，可能會減少生物多樣性，從而威脅淡水生態系統的結構和功能(Suna et al., 2018)。因此，硝酸鹽控制與減排是水生態環境恢復中一個重要而具有挑戰性的問題。

　　生物膜是微生物在地表環境中的主要聚集形式和棲息地(Flemming et al., 2019)，廣泛分布于土壤、海洋和淡水環境中。它是由細菌、真菌、藻類等多種微生物和一些原生動物、小型無脊椎動物及它們周邊的細胞外多聚物(extracellular polymeric substances, EPS)共同組成的一個微型生態系統(Flemming et al., 2016)。在淡水水體中，生物膜主要存在于巖石、沉水植物等固體基質表面，強烈影響水體中以及水-固界面間物質的遷移轉化和元素生物地球化學循環(姜星宇等, 2016)。大陸水系的氮循環過程通常與河岸帶的功能有關，河流-地表水界面有助于氮轉化的發生，而河床生物膜則是其中的主要貢獻者(Trimmer et al., 2012)，在河流硝化-反硝化等營養循環中起到關鍵作用(Mu et al., 2020)。一方面，生物膜中微生物的固氮作用是許多低營養湖泊不可或缺的氮來源。另一方面，在一些富營養化湖泊中，微生物介導的硝化與反硝化的耦合過程是氮去除的主要生物途徑。研究表明，輸入水生系統的氮在微生物的反硝化作用下可以去除30%~50%，而每年淡水系統(地下水、湖泊、河流)反硝化量約占全球反硝化總量的20%(Seitzinger et al., 2006)。

　　隨著氮素面源污染問題的加劇(楊林章等, 2018)，較多的研究著眼于自然水體中生物膜通過反硝化作用對氮素的去除轉化效應，提高了水體的脫氮效率(Jasper et al., 2014)。Baldwin等(2006)在對河流生物膜的研究中發現，在生物膜豐富的地方，反硝化作用對硝酸鹽的去除可達到50%。利用微藻生物膜處理城市污水的研究發現，連續光照條件下，生物膜對水體氮的去除速率可達到(1.0 ext{g}· ext{m}^{-2}· exttl7lrfpl^{-1})(Boelee et al., 2011)。Ishida等(2007)在池塘和濕地中布設底棲網，所得均勻生長的生物膜的反硝化潛力甚至高于底層沉積物。夏永秋等的實驗表明，生物膜通過反硝化除氮的貢獻介于水柱和沉積物之間，且水柱、生物膜和沉積物三者間存在強烈的交互作用，能較好的解釋反硝化速率(Xia et al., 2018)。

　　生物膜的形成高度依賴周邊環境，主要因素包括依附的基質類型、水文要素、營養鹽濃度、生物因素及光照等物理環境因素。微生物細胞粘附與物體表面的初始附著強烈依賴于基質的表面性質(Murdock et al., 2007)，主要是基質表面的粗糙度、顆粒物大小及氣孔。基質表面的粗糙度會直接影響細胞與基質的粘附行為。水文條件也會調節微生物的營養來源，水流會不斷將溶解氧和營養物質運輸到生物膜表面，刺激細胞代謝，促進生物膜的生長以及對有機物質的消耗(Lyu et al., 2015)，因此水流條件較快的情況下，一般會有更多的好氧細菌。但湍流條件下的水流的沖刷也會使外層粘附個體脫落，限制生物膜上細菌和藻類數目的增加(Arnon et al., 2007)。此外，較多的研究表明水體中營養鹽的含量會影響生物膜上微生物生長和藻類的群落組成(Biggs et al., 1989; Su et al., 2017; Lu et al., 2018)。比如，在氮元素缺乏時，生物膜會出現較多的固氮微生物;而氮充足的條件下，生物膜則會具有較多的反硝化微生物和較高的硝酸還原酶活性。一般而言，當水體的營養水平較高時，生物膜的生物量較高(Ozkan et al., 2010)，生物膜的生長速度也更快(李今, 2005)。富營養化和貧營養化湖泊中生物膜的微生物和藻類組成有明顯的組成和結構差別(Raeder et al., 2010)，富營養湖泊形成的生物膜相對較厚且不穩定(王文林等, 2014)。光照強度和溫度是影響水體中生物膜的主要物理環境因素(Zhao et al., 2018)。光照會顯著影響藻類的生長，在密閉的河流中，常常存在大量的絲狀細菌、真菌或原生動物等異養生物，而在光照條件下充足的環境下，絲狀或片狀藻類的生物量占優勢。溫度制約著水中有機物質的溶解度、微生物生長速率和一系列的酶促反應(吳永紅等, 2005)，影響微生物的生長代謝。此外，水體中氧離子濃度、氧化還原電位也會使微生物數量存在一定的空間特異。

　　大量研究對生物膜開展了微生物層面的探究。自然淡水生物膜中存在變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等具有反硝化作用的細菌(Fang et al., 2017; Li et al., 2019)。此外，在生物膜上也檢測到了大量與反硝化作用相關的功能基因，如nirS、nirK和nosZ等(Vila-Costa et al., 2014; Li et al., 2019)。此外，影響河流生物膜內細菌群落的環境因素很多，如溫度、pH、溶解性有機碳和土地利用方式等均與河流生物膜群落的變化有關。Lear等(2009)和Wang等(2011)的研究也揭示了不同土地利用方式下流域細菌群落組成的差異。

　　千島湖是一個大型人工深水湖，是國家重點保護的飲用水源。進入千島湖的河流數量眾多，水文過程復雜，水質存在不同程度的污染(Han et al., 2013; Li et al., 2017)，對河流區的治理對于湖區的水質保護具有重要意義。然而，入湖河流大多屬于山區河流，河床由大量的礫石組成，故附著在礫石上的生物膜成為河流硝態氮去除的重要參與者。因此，探究河床附石生物膜的生態環境功能和氮的遷移轉化等環境行為機制具有重要意義。基于此，本研究調查了千島湖上游梓桐流域的現場水質理化參數，并采集了相應的礫石樣品，通過培養實驗培養測定流域河床附石生物膜的反硝化潛力，以闡明環境因子對梓桐的附石生物膜反硝化潛力的影響，同時結合高通量測序技術，從微生物群落組成角度探究附石生物膜的反硝化潛力。本研究對于探究山區河流礫石底質河床的氮素去除能力具有重要意義，可為流域氮素精確管理和湖泊水質富營養化管理目標提供科技支撐。

　　2 材料與方法(Materials and methods)

　　2.1 研究區域概況

　　千島湖(新安江水庫)位于中國東南部，壩高105 m，長462 m，平均水深30.44 m。千島湖典型蓄水位108 m，湖面面積(580 ext{km}^2)，水量(178.4×10^8 ext{m}^3)，流域面積達(10480 ext{km}^2)。水庫主要接受周邊多條河流的地表徑流，包括新安江、富強溪、武強溪等(Zhang et al., 2019)。因此，對河流區的治理對于湖區的水質保護具有重要意義。鑒于千島湖的入湖河流大多屬于山區河流，河床由大量的礫石組成，故附著在礫石上的生物膜成為河流硝態氮去除的重要參與者。因此，探究河床附石生物膜的生態環境功能和氮的遷移轉化機制具有重要意義。本研究選取梓桐源流域為研究對象，梓桐源發源于姜家鎮與梓桐鎮交界的夫畈嶺，于梓桐碼頭流入千島湖，主流長度為，集雨面積為(130.54 ext{km}^2)。從源頭到入湖口布設了5個點位(圖1)，分別于2022年11月、2023年1月、2023年5月和2023年7月進行水樣和附石生物膜樣品的采集。

　　通過地理空間數據云(Geospatial Data Cloud, http://www.gscloud.cn/)收集千島湖流域DEM的數字高程數據，通過GlobeLand30(http://www.globallandcover.com/)收集2020年的全球土地覆被數據。采樣點位為各匯水區的出水口，以確保包括向各點供水的土地面積。使用ArcGis 10.7軟件再次計算每個集水區內土地利用類型的百分比。

　　圖1 流域采樣點分布 Fig. 1 Distribution of sampling points in the basin

　　(注：圖中展示了梓桐源流域5個采樣點的空間分布，涵蓋從源頭到入湖口的不同區域，結合經緯度和土地利用類型標注)

　　2.2 數據收集與處理

　　2.2.1 水質數據

　　采集河流表層(水下0.5 m)水樣后立即使用0.45 μm孔徑的玻璃纖維濾膜(Whatman GF/F)過濾，使用連續流動分析儀(德國)測定濾后樣品的(NO_3^--N)、(NO_2^--N)、(NH_4^+-N)和(PO_4^{3-})濃度，濾膜經過熱乙醇提取后，利用分光光度法測定葉綠素(Chl a)含量;參照《水和廢水分析方法》(SEPA, 2002)測定未過濾樣品的總氮(TN)、總磷(TP)、溶解性總磷(DTP)和溶解性總氮(DTN)濃度。

　　2.2.2 附石生物膜生物量測定

　　將采集的礫石樣品置于預清洗干凈的聚氯乙烯瓶中，加入400 mL去離子水，超聲振蕩30 min。將振蕩后的洗脫液負壓經過兩張0.45 μm孔徑的玻璃纖維濾膜(Whatman GF/F)過濾，其中一張濾膜烘干恒重后之后置于馬弗爐經過550 ℃燃燒4 h后稱重，計算重量差得到附著生物膜的無灰干重(AFDM)。另一張濾膜經過熱乙醇提取后，利用分光光度法測定葉綠素含量。

　　2.2.3 反硝化速率測定

　　將采集的礫石放入2 L的水袋中，加入1.5 L原水后排凈空氣，置于培養箱中避光培養24 h，設置培養箱溫度與水體溫度一致。分別于培養前后取水袋中的水，裝入3支12 mL的Labco頂空瓶中，立即加入飽和氯化鋅溶液((ZnCl_2))固定，采樣結束后利用膜進樣質譜儀(Membrane Inlet Mass Spectrometry, MIMS)測定Labco瓶內溶解性氣體(N_2)的含量，通過培養前后的(N_2)差值計算沉積物中的潛在反硝化速率。

　　2.2.4 DNA提取、PCR擴增和測序

　　使用FastDNA®SPIN土壤試劑盒(MP biomedicals, Solon, OH, USA)提取生物膜總基因組DNA，并通過分光光度法(Tecan Spark, 瑞士)檢測DNA的濃度和純度。使用公認的338F/806R引物在細菌16S rRNA基因的V3-V4區域進行PCR擴增(Fadrosh et al., 2014)。PCR擴增條件參考Yu等(2023)的研究。使用AMPure XP純化后，通過Illumina MiSeq平臺對PCR產物進行測序后，生成片段長度為250 bp的雙端讀數。使用CLC微生物基因組學模塊進行生物信息學分析，包括修剪引物序列、去除嵌合體、對操作分類單元(OTU)進行聚類、過濾低豐度OTU(<10個讀數)，并基于SILVA數據庫對其進行分類信息分配。在微生物樣品測定時，針對前期對于水質以及附著生物膜理化指標的測定以及分析結果，發現位于入湖口的S5點位指標波動較大，猜測該點位受到入湖口水量變化的影響比較大，因此對附著生物膜微生物檢測時去除了該點位。

　　2.2.5 統計分析

　　使用Origin 9.1軟件和SPSS統計軟件進行數據分析。使用非參數Kruskal-Wallis檢驗比較獨立組數據以評估它們之間的差異，如果p值小于0.05，則認為存在顯著性差異。采用皮爾遜和斯皮爾曼相關系數評估各組數據之間的相關性，在本研究中，當P值小于0.05，相關系數r大于0.4，則認為兩因素間有相關性且相關性具有顯著的統計有效性。采用CANOCO 5(Microcomputer Power, Ithaca, NY, USA)進行冗余分析(RDA)，探討環境參數與生物膜群落組成之間的關系。

　　3 結果與分析(Results and analysis)

　　3.1 梓桐源水體理化指標時空變化特征

　　采樣點的理化指標(水溫、濁度、Chl a、電導率和溶解氧)變化如圖2所示。河流四季的水溫表現為夏季((21.69±1.31) ℃)>春季((18.82±0.83) ℃)>秋季((17.67±0.49) ℃)>冬季((15.00±1.09) ℃)。濁度的季節變化趨勢和溫度一致，表現為夏季(3.34±1.24)>春季(1.96±1.27)>秋季(1.76±2.20)>冬季(1.04±1.10)，濁度在空間上從上游到下游逐漸增加，表現為S5(3.57±1.64)>S4(2.68±1.83)>S3(1.75±1.22)>S2(1.66±1.33)>S1(0.44±0.39)。Chl a濃度表現為秋季((1.02±0.85) μg·L?¹)>冬季((0.87±0.64) μg·L?¹)>春季((0.65±0.42) μg·L?¹)>夏季((0.48±0.09) μg·L?¹)，在空間上也大致表現出從上游到下游逐漸增加的趨勢，S1的濃度最低((0.12±0.04) μg·L?¹)，S5的最高((1.89±1.47) μg·L?¹)。溶解氧濃度表現為秋季((10.31±0.78) mg·L?¹)>冬季((10.16±0.35) mg·L?¹)>春季((9.93±0.54) mg·L?¹)>夏季((9.42±0.61) mg·L?¹)，空間上呈現出上游高下游低的趨勢，濃度最低的點位為S4((9.39±0.51) mg·L?¹)，其次是S5((9.54±1.10) mg·L?¹)。

　　圖2 采樣點理化指標的季節分布 Fig. 2 Seasonal distribution of physical and chemical indicators at sampling sites

　　(注：圖中分別展示了春、夏、秋、冬四季各采樣點的水溫、濁度、Chl a、電導率和溶解氧的分布特征)

　　梓桐源水體氮濃度的時空分布如圖3所示。從空間分布來看，除了冬季枯水期以外，梓桐流域從上游到下游呈現氮濃度增加的趨勢，而在接近入湖口時，由于水量增大出現營養鹽被稀釋TN濃度小幅度降低的情況。冬季枯水期，流域TN濃度高值出現在上游區。從季節分布來看，流域TN濃度最高值出現在春季((2.76±0.31) mg·L?¹)，夏季次之((2.15±0.28) mg·L?¹)，秋季流域TN濃度最低((1.34±0.23) mg·L?¹)。水體中的氮主要以溶解態的形式存在，占比高達60.8%-98.5%，(NO_3^--N)為溶解態氮的主要成分，占比在70%以上。流域中(NO_2^--N)和(NH_4^+-N)的占比極低，分別占TN的0.1%~1.6%、0.1%~1.4%。

　　圖3 采樣點氮營養鹽季節分布 Fig.3 Seasonal distribution of nitrogen nutrients at sampling sites

　　(注：圖中分別展示了春、夏、秋、冬四季各采樣點的TN、DTN、(NO_3^--N)、(NO_2^--N)、(NH_4^+-N)濃度分布)

　　3.2 附石生物膜時空分布特征

　　選取單位面積附石生物膜的AFDM和Chl a作為生物膜生物量的表征。附石生物膜生物量的時空變化如圖4所示。AFDW和Chl a的整體變化趨勢一致，從空間分布來看AFDW和Chl a的高值均出現在耕地占比較高的農田區，其中，春季AFDM和Chl a的高值出現在S3((6.47±1.60) g·m?²，(47.73±3.44) mg·m?²)，夏季出現在S5((4.57±0.49) g·m?²，(36.01±4.35) mg·m?²)，秋季出現在S4((9.19±0.81) g·m?²，(71.03±10.11) mg·m?²)，冬季出現在S4((5.09±0.12) g·m?²，(24.18±2.23) mg·m?²)。從季節分布來看，春季的AFDW和Chl a最高((5.63±0.91) g·m?²，(44.2±17.22) mg·m?²)，秋季次之((4.71±3.19) g·m?²，(34.06±25.43) mg·m?²)。夏冬兩季的AFDW和Chl a較低，夏季分別為((3.06±1.04) g·m?²和(14.00±11.30) mg·m?²)，冬季分別為((2.90±1.16) g·m?²和(15.87±4.72) mg·m?²)。

　　為探究流域河床附石生物膜的生物量與水體營養鹽濃度之間的關系，將附石生物膜的AFDM和Chl a與TN、TP進行了相關性分析，分析結果如圖5所示。除冬季枯水期以外，AFDM和Chl a與水體TN濃度均呈正相關，其中春秋兩季AFDM與TN呈顯著正相關((r=0.65)，(p<0.05);(r=0.49)，(p<0.05))，Chl a與TN也呈顯著正相關((r=0.85)，(p<0.05);(r=0.77)，(p<0.01))。春夏兩季TP濃度與AFDM和Chl a呈正相關，其中AFDM與TP在春夏兩季均呈顯著正相關((r=0.52)，(p<0.05);(r=0.64)，(p<0.05))，Chl a與TP在夏季呈顯著正相關((r=0.67)，(p<0.01))。

　　圖4 附石生物膜生物量的季節分布 Fig. 4 Seasonal distribution of epilithic biofilm biomass

　　(注：圖中分別展示了春、夏、秋、冬四季各采樣點的AFDM和Chl a分布特征)

　　圖5 附石生物膜生物量與氮磷營養鹽的線性擬合關系 Fig. 5 Linear fit of epilithic biofilm biomass to nitrogen and phosphorus concentrations

　　(注：圖中展示了不同季節附石生物膜AFDM、Chl a與TN、TP的線性相關關系及相關系數和顯著性)

　　3.3 梓桐源附石生物膜的反硝化潛力

　　梓桐源附石生物膜的反硝化速率測定結果顯示，不同季節不同點位之間附石生物膜的反硝化潛力不同(圖6)。夏季附石生物膜反硝化潛力最高，為((7.25±2.56) μmol·m?²·h?¹)，秋季次之，為((5.40±4.91) μmol·m?²·h?¹)，冬季為((3.98±2.08) μmol·m?²·h?¹)，春季反硝化速率最低，為((3.33±1.49) μmol·m?²·h?¹)。其中，秋季不同點位間附石生物膜反硝化速率差異較大，反硝化速率的最低值和最高值，分別出現在點位S1((0.55 μmol·m?²·h?¹)和S4((14.34 μmol·m?²·h?¹)。附石生物膜生物量與反硝化潛力的擬合結果如圖6所示，反硝化潛力與AFDM和Chl a均呈顯著正相關((r=0.53)，(p<0.05);(r=0.49)，(p<0.05))。

　　除了營養鹽濃度外，附石生物膜反硝化速率受到多種環境因子的共同影響。將這些環境因子與反硝化速率進行了Spearman相關性分析，結果如表1所示，WT和NTU與反硝化速率呈顯著正相關((r=0.46)，(p<0.05);(r=0.49)，(p<0.05))，DO與反硝化速率呈顯著負相關((r=-0.64)，(p<0.01))。

　　圖6 附石生物膜反硝化潛力((Delta N_2))及其與生物量之間的線性擬合關系 Fig. 6 Denitrification potential of epilithic biofilms and its linear fit to biomass

　　(注：左圖展示了各采樣點不同季節的反硝化潛力分布，右圖展示了反硝化潛力與AFDM、Chl a的線性相關關系)

　　表1 環境因子與附石生物膜反硝化速率的Spearman相關性分析 Table 1 Spearman's correlation analysis between environmental factors and denitrification rate of epilithic biofilm

　　| 項目 | 反硝化速率 | WT | DO | NTU | Chl a | EC |

　　|------|------------|----|----|-----|-------|----|

　　| 反硝化速率 | 1.00 | 0.46* | -0.64 | 0.49* | 0.26 | -0.03 |

　　| WT | 0.46* | 1.00 | -0.58 | 0.64 | 0.21 | 0.22 |

　　| DO | -0.64 | -0.58 | 1.00 | -0.51* | -0.29 | 0.18 |

　　| NTU | 0.49* | 0.64 | -0.51* | 1.00 | 0.55* | 0.03 |

　　| Chl a | 0.26 | 0.21 | -0.29 | 0.55* | 1.00 | -0.03 |

　　| EC | -0.03 | 0.22 | 0.18 | 0.03 | -0.03 | 1.00 |

　　注：(*p<0.05)，(p<0.01)

　　3.4 附石生物膜微生物群落特征

　　在α多樣性方面，不同季節和點位之間的Chao1指數值和Richness存在顯著差異(圖7)。夏季的Chao1指數和Richness指數最高，點位S3的Chao1指數和Richness指數值最低。β多樣性分析顯示，四季間以及點位間的細菌群落均存在顯著差異(Anosim值，(p=0.001))。

　　圖7 附石生物膜微生物群落的α多樣性(a~d)和β多樣性(e~f) Fig. 7 Alpha diversity(a~d)and beta diversity(e~f)of microbial communities in epilithic biofilms

　　(注：a~d分別展示了不同季節、不同點位的Chao1指數和Richness指數;e~f展示了基于MDS分析的微生物群落β多樣性特征)

　　門水平上的細菌分類如圖8所示，Others表示平均豐度小于1%的門水平上的細菌分類，優勢菌門為變形菌門(Proteobacteria)(24.32%~62.18%)、藍細菌(Cyanobacteria)(12.30%~48.36%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(4.54%~26.81%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(0.84%~17.01%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(1.61%~11.14%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(0.37%~11.22%)、厚壁菌門(Firmicutes)(0.21%~5.33%)和放線菌門(Actinobacteria)(0.36%~2.07%)。

　　圖8 附石生物膜細菌群落門的相對豐度 Fig. 8 Relative abundance of epilithic biofilm bacterial community clades

　　(注：圖中展示了春、夏、秋、冬四季各采樣點細菌群落門水平的相對豐度分布)

　　占比前20的屬的相對豐度如圖9、表2所示，包含3個反硝化細菌屬：紅細菌屬(Rhodobacter)(0.99%~8.95%)、不動桿菌屬(Acinetobacter)(0.17%~7.57%)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(0.29%~3.73%)。所有生物膜樣品中共監測出40個優勢屬(至少在一個生物膜樣品中排前10)，其中包含6個反硝化細菌屬(圖9)，除了Rhodobacter、Acinetobacter和Sphingomonas，還包括黃桿菌屬(Flavobacterium)(0.08%~2.24%)、嗜氫菌(Hydrogenophaga)(0.13%~1.25%)和芽孢桿菌(Bacillus)(0.02%~1.99%)。反硝化是自然生態系統中氮循環的重要一環。在本研究中，Rhodobacter是附石生物膜中最主要的反硝化細菌，其次是Acinetobacter。Rhodobacter在點位S4豐度最高，Acinetobacter在S1豐度最高，二者的豐度均在冬季占比最高。

　　圖9 反硝化細菌屬的相對豐度 Fig. 9 Relative abundance of denitrifying bacterial genera

　　(注：左圖展示了各采樣點反硝化細菌屬的相對豐度，右圖展示了不同季節反硝化細菌屬的相對豐度)

　　表2 附石生物膜細菌群落優勢屬 Table 2 Relative abundance of dominant genera of epilithic biofilm bacterial communities

　　| 屬 | 春季 | | | | 夏季 | | | | 秋季 | | | | 冬季 | | | |

　　|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|------|

　　| | S1 | S2 | S3 | S4 | S1 | S2 | S3 | S4 | S1 | S2 | S3 | S4 | S1 | S2 | S3 | S4 |

　　| Tychonema | 7.58 | 24.32 | 3.06 | 10.07 | 0.17 | 2.97 | 39.67 | 1.56 | 4.61 | 2.81 | 17.92 | 1.10 | 0.48 | 0.58 | 0.50 | 0.42 |

　　| Luteolibacter | 6.01 | 3.33 | 0.67 | 1.41 | 2.60 | 3.02 | 4.41 | 3.31 | 1.91 | 6.57 | 4.42 | 6.71 | 0.52 | 9.67 | 2.35 | 14.44 |

　　| Pleurocapsa | 2.02 | 4.25 | 2.98 | 0.92 | 2.78 | 1.59 | 4.13 | 0.39 | 1.08 | 1.12 | 6.98 | 2.20 | 0.08 | 0.46 | 0.06 | 2.65 |

　　| Rhodobacter | 5.31 | 1.29 | 4.71 | 3.84 | 4.17 | 1.20 | 7.77 | 2.44 | 6.45 | 2.43 | 2.17 | 1.83 | 1.37 | 8.95 | 0.99 | 1.03 |

　　| Pirellula | 1.84 | 3.72 | 2.16 | 2.99 | 2.56 | 3.22 | 0.44 | 1.67 | 3.39 | 1.11 | 0.72 | 6.04 | 5.64 | 5.19 | 5.27 | 6.28 |

　　| Acinetobacter | 7.57 | 0.25 | 0.17 | 0.24 | 4.99 | 0.43 | 0.27 | 0.26 | 0.94 | 0.54 | 1.84 | 1.24 | 2.69 | 3.79 | 5.67 | 5.57 |

　　| Blastocatella | 0.42 | 9.43 | 0.11 | 0.52 | 0.15 | 6.66 | 0.65 | 0.88 | 5.31 | 6.65 | 1.64 | 0.19 | 2.90 | 0.30 | 0.59 | 0.14 |

　　| Aliterella | 0.04 | 4.18 | 0.73 | 0.46 | 0.05 | 2.30 | 4.24 | 0.23 | 0.36 | 13.57 | 3.75 | 0.13 | 0.50 | 0.11 | 0.43 | 0.10 |

　　| AAP99 | 0.58 | 0.96 | 0.87 | 0.64 | 2.94 | 2.93 | 1.35 | 1.13 | 0.20 | 0.63 | 0.47 | 2.64 | 2.12 | 5.29 | 2.28 | 3.42 |

　　| Flavisolibacter | 0.10 | 5.72 | 0.07 | 0.35 | 0.09 | 4.30 | 6.49 | 0.93 | 1.45 | 4.41 | 2.67 | 0.09 | 0.95 | 0.07 | 0.12 | 0.07 |

　　| Sphingorhabdus | 1.26 | 8.43 | 3.02 | 0.88 | 2.12 | 1.88 | 0.93 | 0.37 | 0.36 | 0.54 | 0.77 | 0.41 | 0.46 | 0.81 | 0.29 | 0.35 |

　　| Porphyrobacter | 0.29 | 2.15 | 2.50 | 0.83 | 0.79 | 3.14 | 1.10 | 0.48 | 1.68 | 0.37 | 0.48 | 0.46 | 2.00 | 0.57 | 4.88 | 0.85 |

　　| Hymenobacter | 0.09 | 3.85 | 0.23 | 0.11 | 0.11 | 0.28 | 2.69 | 0.12 | 0.28 | 3.76 | 7.78 | 0.06 | 1.45 | 0.12 | 0.19 | 0.11 |

　　| Sphingomonas | 0.56 | 3.73 | 0.48 | 0.67 | 0.75 | 2.55 | 2.59 | 0.85 | 1.44 | 2.49 | 2.47 | 0.30 | 0.84 | 0.55 | 0.29 | 0.38 |

　　| Brevundimonas | 3.84 | 1.83 | 0.88 | 0.69 | 0.44 | 1.50 | 2.04 | 0.32 | 1.24 | 0.64 | 4.31 | 0.35 | 0.66 | 0.78 | 0.41 | 0.41 |

　　| Tabrizicola | 0.42 | 1.02 | 0.40 | 1.23 | 0.37 | 2.02 | 0.72 | 1.36 | 1.06 | 0.31 | 0.51 | 1.05 | 1.29 | 0.99 | 0.89 | 1.04 |

　　| Dinghuibacter | 0.20 | 0.62 | 1.00 | 2.41 | 0.22 | 1.44 | 0.51 | 1.70 | 0.89 | 0.45 | 0.28 | 1.50 | 0.98 | 0.58 | 1.00 | 0.33 |

　　| Pseudorhodobacter | 0.41 | 0.19 | 1.01 | 0.31 | 2.15 | 0.33 | 0.13 | 0.19 | 0.16 | 0.15 | 0.18 | 2.36 | 0.45 | 2.29 | 0.74 | 2.06 |

　　| Limnohabitans | 0.86 | 0.09 | 1.92 | 0.52 | 0.43 | 0.19 | 0.12 | 0.19 | 0.96 | 0.30 | 0.35 | 0.50 | 2.33 | 1.57 | 1.49 | 0.85 |

　　| Others | 78.46 | 37.49 | 43.57 | 71.36 | 73.38 | 54.39 | 32.89 | 75.36 | 57.65 | 35.65 | 47.97 | 53.73 | 55.61 | 59.20 | 59.88 | 45.90 |

　　將反硝化細菌屬與反硝化速率進行Spearman相關性分析，發現反硝化速率與Rhodobacter的相對豐度呈顯著正相關((p<0.05)，(r=0.58))，與其他反硝化細菌屬無顯著相關性。采用RDA方法描述了環境參數與附石生物膜優勢屬的關系(圖10)，結果顯示反硝化細菌Rhodobacter與總氮濃度呈正相關，此外，EC、pH、NTU等環境因子也是影響反硝化細菌的因素。

　　圖10 環境因子與優勢屬之間的冗余分析 Fig. 10 Redundancy analysis between environmental factors and dominant genera

　　(注：圖中展示了環境因子(WT、DO、NTU、TN等)與優勢細菌屬之間的冗余分析結果，箭頭方向表示相關性趨勢，長度表示影響程度)

　　4 討論(Discussion)

　　4.1 梓桐源水體理化指標時空變化原因分析

　　濁度在季節上表現為夏季>春季>秋季>冬季，在空間上表現為從上游到下游逐漸增加，主要與降雨和人類活動有關。梓桐源處于亞熱帶季風氣候區，年均降水量約1733 mm，3-5月為春汛期，6-7月為主汛期，枯水期為10月-翌年2月(趙星辰等, 2022)。春夏兩季大量的降雨沖刷增加了支流周邊的土壤侵蝕，大量顆粒物進入流域，造成春夏兩季水體濁度較高。下游點位耕地面積占比大，農業活動對土壤擾動頻繁，導致表層土壤結構松散(陸淑寧等, 2024)，受到的侵蝕程度更高，顆粒物更易進入水體，導致下游點位的濁度高于耕地面積占比較低的上游點位。

　　溶解氧濃度在季節上表現為秋季>冬季>春季>夏季，在空間上表現為上游高、下游低。秋冬季水體中的生物活動較弱，溶解氧主要受溫度影響，并且此時溫度較低，氧氣在水體中的溶解度較大。雖然春夏兩季浮游植物大量增殖依靠光合作用產生氧氣，但此時溫度升高，降低了氧氣的溶解度，造成氧氣逸出(劉瑞娟等, 2023)。此外，春夏兩季降雨集中，降雨徑流攜帶營養鹽進入接收水體影響水質，養分負荷的增加促進了藻類增殖，藻類生物量過高降低了流域的溶解氧水平(Zhang et al., 2015)。因此相較于秋冬季節，春夏季節的溶解氧含量有所降低。由于下游點位集水區耕地和居民區占比更高，帶來了更多的營養鹽輸入，造成浮游植物大量繁殖降低水體溶解氧水平(Shi et al., 2023)。

　　梓桐流域氮營養鹽濃度主要集中在春夏兩季，從空間分布來看，除了冬季枯水期以外，呈現從上游到下游增加的趨勢。與濁度的變化一致，由于春夏兩季降雨集中，流域居民區及耕地區的人類活動導致大量營養鹽隨降雨徑流進入水體中，提高了春夏兩季的營養鹽濃度。而下游耕地區及居民區的占比更高，導致了下游水體營養鹽濃度更高。此外，Chl a濃度在空間上也大致表現出從上游到下游逐漸增加的趨勢，這是因為營養鹽是藻類生長的一個重要影響因素，營養鹽濃度的增加會引起藻類的增殖(Suna et al., 2018)，因此下游點位的Chl a濃度更高。

　　4.2 附石生物膜形成的影響因素

　　在本研究中，附石生物膜生物量(AFDM和Chl a)在時間和空間上都存在著差異，這是由于生物膜的生長受到不同環境因子的影響(Lu et al., 2018; Zhao et al., 2018; Zheng et al., 2022)。相關研究表明，水體中的營養鹽水平是影響附石生物膜生物量的一個重要因素。當營養鹽水平較高時，生物膜的生物量較高，生物膜生長水平也較快，導致附石生物膜生物量的差異。Teissier等(2002)的研究表明當河流流經大型城市之后，生物膜的生物量明顯升高;Artigas等(2015)探究不同營養鹽水平對河流生物膜結構和活性的影響顯示，氮磷濃度降低，生物膜細菌密度和Chl a也降低。本研究對附石生物膜的AFDM和Chl a與梓桐流域水體TN和TP的相關性分析結果表明，除冬季枯水期以外，AFDM和Chl a與水體TN濃度均呈正相關，并且春秋兩季的TN濃度與AFMDM和Chl a均呈顯著正相關。春夏兩季的TP濃度與AFDM和Chl a呈顯著正相關。從空間上看，下游點位(S3、S4和S5)的耕地占比和建筑用地占比更高，活躍的農業活動和人類生活導致流域營養鹽濃度相對較高，因此其附石生物膜的生物量也相對較高。

　　除營養鹽水平外，溫度是影響生物膜的重要環境因素之一。相關研究表明，較高的溫度條件下，附石生物膜的厚度較高，其Chl a和胞外聚合物(EPS)的含量也較高。溫度過高或過低都會限制藻類的生長，相較于高溫來說，低溫更不利于附著生物膜藻類的生長(Zhao et al., 2018)。Rosa等(2013)對影響附石生物膜呼吸作用的探究表明，水溫升高能刺激附石生物膜生物量的增加，進而刺激其呼吸作用。本研究中，水體春、夏、秋、冬四季的平均溫度分別為(18.82±0.83)、(21.69±1.31)、(17.67±0.49)和(15.00±1.09) ℃，因此，冬季附石生物膜生物量最低的原因之一可能是冬季的水體溫度最低，使藻類生長受到限制。

　　4.3 附石生物膜反硝化潛力影響因素

　　流域附石生物膜的生物量是影響反硝化潛力的重要因素，Teissier等(2002)對法國加隆河河床礫石附石生物膜的研究表明，生物膜生物量與其在黑暗條件下的反硝化速率之間呈現出非常顯著的正相關關系。Lyautey等(2013)對光氧河流天然生物膜的研究表明，附石生物膜反硝化酶活性與AFDM呈顯著正相關，且兩者之間呈指數分布關系。本研究的相關性分析結果也表明附石生物膜生物量與反硝化速率呈顯著正相關。附石生物膜生物量的最高值出現在秋季的S4點位，AFDM和Chl a分別為(9.19±0.81) g·m?²和(71.03±10.11) mg·m?²，而反硝化速率最高值也出現在秋季的S4點位，為14.34 μmol·m?²·h?¹。

　　附石生物膜反硝化速率還受多種環境因素的影響。Spearman相關分析顯示，WT和NTU與反硝化速率呈顯著正相關，DO與反硝化速率呈顯著負相關。溫度是控制反硝化過程的重要因素，它通過影響參與反硝化底物水解和硝酸鹽還原過程的酶的活性來控制反硝化過程。在低溫條件下，碳源水解效率和反硝化菌的活性均下降，導致反硝化速率下降(Wang et al., 2016)。Bouletreau等(2012)的研究表明，光氧河流附石生物膜的反硝化過程對溫度有較強的依賴性，溫度較高的處理組生物膜的反硝化活性也更強。由于反硝化微生物以兼性厭氧細菌為主，反硝化過程一般發生在低氧或厭氧的條件(Ghafari et al., 2008; Wang et al., 2016)，因此DO的升高不利于附石生物膜反硝化過程的進行，Kemp等(2002)的研究也表明，當生境缺氧時，河流基質的反硝化作用會顯著增強。此外，NTU與反硝化速率呈顯著正相關，NTU的增加表征著水體懸浮物質的增加。一方面，懸浮物中含有有機碳，可以為反硝化過程提供電子，因此懸浮物的增加提高了反硝化速率(Zhang et al., 2020a)。另一方面，懸浮物的增加會增強上覆水的硝化作用，由此產生的硝酸鹽供應增加，進而導致河床反硝化作用的加強(Xia et al., 2017)。

　　4.4 附石生物膜微生物群落季節變化

　　基于物種相對豐度分析了微生物α多樣性和β多樣性特征(圖7)，結果顯示，附石生物膜微生物α多樣性在不同季節和不同點位之間存在顯著差異，β多樣性分析結果也表明不同季節和點位之間附石生物膜微生物群落之間存在差異。Chao1指數和Richness指數均顯示夏季的群落豐富度最高，冬季最低，這可能因為微生物群落受水體溫度的影響，夏季水體能滿足大多數細菌的動力區溫度且有利于細菌生長繁殖，冬季低溫則對細菌的生長繁殖產生抑制作用(馮勝等, 2006; 胡鵬等, 2019; 丁寧等, 2023)。此外，由于夏季降雨量較大，地表徑流攜帶大量陸生微生物進入水體，導致微生物群落豐度較高(Mansfeldt et al., 2020)。點位S3的α多樣性最低，可能是由于點位S3附近的耕地和城鎮用地占比最高，排放的污染物包含了大量的營養鹽。研究表明，硝酸鹽的富集會顯著降低狐尾藻附著生物膜細菌群落的α多樣性(張松賀, 2021)，在本研究中，除冬季枯水期以外，S3點位的(NO_3^--N)濃度也最高。

　　本研究在附石生物膜中共檢測出6種優勢反硝化細菌屬，其中Rhodobacter是最主要的反硝化細菌，Acinetobacter次之，相關研究也表明Rhodobacter和Acinetobacter是附著生物膜的優勢反硝化細菌(Idi et al., 2015; Pang et al., 2016; 張松賀, 2021)。6種反硝化細菌屬相對豐度與反硝化速率的Spearman相關性分析顯示，反硝化速率與Rhodobacter呈顯著正相關，表明Rhodobacter是附石生物膜反硝化的主要貢獻者。這可能由于Rhodobacter多屬于光合細菌，包括光合自養(厭氧型)、光合異養(厭氧/光照)或化學異養(需氧)型(馬強等, 2011)。由于該河流水深較淺，光照充足，有助于可利用多種有機化合物作為碳源和電子供體在厭氧/好氧條件下進行光異養/自養生長的紅桿菌屬(Rhodobacter)在此成為優勢菌種(楊文煥等, 2020)。研究發現Flavobacterium、Pseudomonas、Hydrogenophaga、Acinetobacter、Rhizobium、Deftia等反硝化菌屬偏好營養相對貧瘠的水生生境(蘆燕等, 2019)。Acinetobacter盡管在極端低溫條件下也具有較高且穩定的氨氮代謝能力(Zhao et al., 2021)。因此，Acinetobacter存在于營養鹽濃度相對較低的S1點位，并且在溫度較低的冬季相對豐度更高。

　　根據反硝化細菌群落結構和沉積物理化因子的冗余分析(RDA)可知，總氮與反硝化優勢菌屬Rhodobacter呈正相關(圖10)，有關研究也表明Rhodobacter的豐度隨著硝酸鹽負荷的增加而增加(Zhang et al., 2020b)。溫度也對反硝化過程產生影響，WT與Sphingomonas呈正相關，主要因為Sphingomonas在28 ℃時具有較好的生長狀態(Chen et al., 2013)，而本研究中流域的WT分布在13.56~23.88 ℃，對反硝化作用的促進隨溫度的升高而增強。

　　5 結論(Conclusions)

　　1)千島湖典型礫石底質入湖河附石生物膜存在明顯的時空變化特征。空間上，附石生物膜的AFDM和Chla的高值出現在耕地占比較高的農田區，時間上，春季的AFDM和Chla最高((5.63±0.91) g·m?²，(44.2±17.22) mg·m?²)，冬季最低((2.90±1.16) g·m?²，(15.87±4.72) mg·m?²)。

　　2)附石生物膜反硝化潛力受河流水環境因素影響。附石生物膜反硝化潛力受生物量的影響，與AFDM和Chl a均呈顯著正相關((r=0.53)，(p<0.05);(r=0.49)，(p<0.05))。此外，水體溫度和濁度的增加都會增加其反硝化速率，溶解氧的增加會降低其反硝化速率。

　　3)Rhodobacter是附石生物膜最主要的反硝化細菌，是反硝化過程的主要貢獻者。高通量測序結果顯示Rhodobacter、Acinetobacter、Sphingomonas、Flavobacterium、Hydrogenophaga和Bacillus是附石生物膜的優勢反硝化細菌屬，其中，Rhodobacter是最主要的反硝化細菌，是反硝化過程的主要貢獻者。反硝化細菌屬的相對豐度受環境因子的影響，水體氮營養鹽的增加和溫度的升高均刺激了反硝化細菌的生長。

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